In vitro: еколого-фізіологічний та молекулярно-генетичний підходи на прикладі роду




Скачати 180.1 Kb.
Дата конвертації24.04.2016
Розмір180.1 Kb.


РЕФЕРАТ
циклу наукових праць
«Збереження біорізноманіття рідкісних видів рослин

у природі і в культурі in vitro: еколого-фізіологічний та молекулярно-генетичний підходи (на прикладі роду Gentiana L.)»,
виконаного авторським колективом у складі
к.б.н. Майорової О.Ю. і Мосули М.З. (Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка), к.б.н. Конвалюк І.І. і к.б.н. Твардовської М.О. (Інститут молекулярної біології і генетики НАН України), та представленого Тернопільським національним педагогічним університетом імені Володимира Гнатюка
Постійне зростання антропогенного навантаження призводить до істотних змін навколишнього середовища і негативно впливає на стан дикої природи. Збереження біорізноманіття, охорона рослинного світу і його генетичного різноманіття (генофонду) стало планетарною проблемою. На перший план виходить вивчення змін геному і поліморфізму різних генетичних елементів у природних популяціях рослин, генотипової і фенотипової стабільності, стратегії адаптації рослин в онтогенезі до несприятливих змін екологічних факторів. З метою збереження біорізноманіття актуальною є комплексна оцінка стану популяцій з урахуванням змін екологічних характеристик і параметрів генетичного різноманіття, що дозволяє прогнозувати перспективи існування і розвитку популяцій за умови дії на них певного поєднання факторів. Особливо це стосується популяцій тих видів, які надмірно експлуатуються або внаслідок різних причин, у тому числі історичних, знаходяться на межі зникнення (Структура популяцій…, 1998; Бармак, 2006).

Саме такого підходу потребують види роду Тирлич (Gentiana L.) в Українських Карпатах, сім з яких занесені до Червоної книги України (2009), і мають природоохоронний статус: зникаючі (G. nivalis L., G. utriculosa L., G. verna L.), вразливі (G. lutea L., G. punctata L.), рідкісні (G. acaulis L., G. laciniata Kit. ex Kanitz). Складність насіннєвого поновлення G. lutea, G. punctata та G. acaulis, зривання генеративних пагонів G. acaulis у букети, надмірне пасторальне навантаження призвели до скорочення їх місцезростань і порушення структури популяцій. Цінність видів G. lutea і G. punctata для офіційної і народної медицини, яка визначається їх фармакологічними властивостями, та потенційна потреба в сировині зумовили необхідність оцінки ресурсів цих видів в Україні для створення фундаментальних засад їх збереження та розробки нових підходів до відновлення їх популяцій.

Проблемі дослідження видів роду Gentiana флори України приділено значну увагу у літературі. Зокрема, фрагментарно вивчено структуру, динаміку та екологічні ніші малих ізольованих популяцій рідкісних видів G. acaulis, G. punctata (Кияк, 2002; 2008). Дещо ширше досліджено G. lutea, зокрема стан його окремих популяцій, а також онтогенетичні особливості в природі та в культурі (Крись, 1972; Бедей, Волощук, 2007; Бедей, 2010; Кобів та ін., 2009; Москалюк, 1999, 2008, 2009; Структура популяцій…, 1998). Однак, ці дослідження є розрізненими і стосуються здебільшого вивчення деяких характеристик окремих популяцій та їхніх локалітетів. Не існує єдиного погляду й на хорологію цих видів у флорі України (Структура популяцій…, 1998; Тирлич жовтий…, 2010).

Молекулярно-генетичний аналіз різних видів родини Gentianaceae є предметом дослідження багатьох учених. Зокрема, Yong Li та ін. (2007) охарактеризували генетичну різноманітність і дослідили генетичну структуру популяцій G. crassicaulis Duthie ex Burk. методом SSR-ПЛР; Zhang X.-L. та ін. (2007) – G. atuntsiensis W.W. Sm. та G. striolata T. N. Ho (ISSR-ПЛР); Ge X.-J. та ін. (2005) – Megacodon stylophorus (Clarke) Smith (ISSR-ПЛР), Raica P. та ін. (2006, 2011) – G. nivalis, G. cruciata L. (RAPD, SSR-ПЛР); Zheng P. та ін. (2011) – G. macrophylla Pall., G. straminea Maxim, G. crassicaulis, G. dahurica Fisch (ISSR-ПЛР). Іншими дослідниками вивчено генетичну різноманітність 11 популяцій G. lutea L. var. aurantiaca з Кантабрійських гір, 4 популяцій G. lutea L. subsp. vardjanii, що локалізовані в Доломітових Альпах, та 15 популяцій G. lutea з Піренеїв. Встановлено високі показники генетичного поліморфізму популяцій G. lutea L. var. aurantiaca (González-López et al., 2014). Проте, при дослідженні генетичного поліморфізму популяцій рослин недостатньо уваги приділяється супутній інформації про характеристики середовища їх зростання. Поряд із цим, наявні літературні відомості з генетичного поліморфізму природних популяцій свідчать про суттєвий вплив екологічних умов на їхню генетичну структуру. Зокрема, встановлено позитивну кореляцію між генетичною різноманітністю, розмірами популяції та життєздатністю окремих рослин Gentianella germanica (Willd.) Börner (Fisher M., 1998).

Для оптимізації збереження генетичної різноманітності на популяційному рівні Боронніковою С.В. зі співробітниками (2009) розроблено методи молекулярно-генетичної ідентифікації та паспортизації генофондів рідкісних і зникаючих видів рослин, які зростають на території Пермського краю. Цими ж вченими створена 5-ти бальна система комплексної оцінки стану популяцій Adonis vernalis L., Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. та Digitalis grandiflora Mill. за 11 критеріями з урахуванням ступеня антропогенного впливу (Боронникова, 2009; Бельтюкова, 2010).

Створення ефективних природоохоронних заходів неможливе без вивчення екологічної і генетичної компонент біорізноманіття. З’ясування генетичної структури популяцій дозволяє отримати інформацію про рівень генетичної гетерогенності та унікальність їх генофонду, виявляти внутрішньовидовий та внутрішньопопуляційний поліморфізм, оцінити гетерозиготність, визначити просторові зв’язки між популяціями та окремими особинами, встановити напрямок розвитку генетичних процесів у популяціях. Лише глибоке знання популяційно-генетичної структури видів рослин дозволить проводити моніторинг її змін і прогнозувати порушення її стабільного відтворення в часі (Политов, 2007). Дане дослідження, яке присвячене аналізу стану популяцій рідкісних видів на основі вивчення екологічних характеристик та оцінки генетичного різноманіття їх популяцій, дозволить поглибити рівень знань про особливості генетичного поліморфізму рідкісних видів рослин, оцінити і певною мірою, спрогнозувати стан популяцій цих видів, намітити і розробити сучасні підходи для моніторингу стану і прогнозу розвитку гірських екосистем.

На сьогоднішній день для збереження природних ресурсів видів роду Gentiana створено штучні плантації на високогірних біостаціонарах Інституту екології Карпат та Львівського національного університету імені І. Франка (Тирлич жовтий…, 2010), зроблено спробу інтродукувати ці види в ботанічні сади (Луніна, 1997; Кульбанська, 2003; Голубенко, 2005; Єфремова, 2006), а також розроблено методи їх культивування in vitro (Страшнюк та ін., 1997; 2002; 2004; 2006; 2008).

Отримання та культивування тканин та органів рослин тирличів in vitro дозволяє використати їх як зручну модель для дослідження організації та функціонування геному в процесах диференціювання – дедиференціювання – редиференціювання, за адаптації до стресових умов росту тощо; а також для прикладних цілей – збереження, оздоровлення і прискореного розмноження цінних генотипів. Використання цих методів, у першу чергу мікроклонального розмноження, з одного боку, дозволить отримати, за відносно невеликий проміжок часу, велику кількість життєздатних рослин; з іншого – існує припущення, що етапи онтогенезу рослин у культурі in vitro (Кунах, 2005) пришвидшені, порівняно з онтогенезом рослин у природі. Тому відновлення популяцій культивованими in vitro рослинами буде швидшим і більш успішним.

Розробка методу мікроклонального розмноження тирличів in vitro наводиться у роботах таких вчених як (Viola, Franz, 1989; Momcilovic, 1997; Feijoo, Iglesias, 1998; Голубенко, 2005; Голубенко та ін., 2006). Відомо, що фінальним і необхідним кроком в усій системі мікроклонального розмноження є акліматизація (Медведєва, 2008). Зроблено спроби перенесення в умови ex vitro (Sharma et al., 1993; Morganetal., 1997; Momcilovic et al., 1997; Butiuc-Keul et al., 2005; Petrova et al., 2011). Репатріація вирощених in vitro рослин у порушені природні популяції може розглядатися як альтернативний метод відновлення ареалів рідкісних видів.

Виходячи із вище вказаного, проведені дослідження є актуальними і перспективними. Одержані експериментальні результати, представлені у циклі наукових праць, мають важливе фундаментальне та практичне значення, а використані підходи співвідносяться із світовими. Усі перераховані нижче закономірності та їхня біологічна інтерпретація отримані вперше.

Метою роботи було розробити комплексний підхід до збереження та відновлення рідкісних видів роду Тирлич (Gentiana L.) на основі оцінки їх еколого-фізіологічних, молекулярно-генетичних характеристик та застосування біотехнологічних методів.

Основні результати та наукова новизна. Авторами вперше отримано низку важливих і в багатьох аспектах пріоритетних результатів, опублікованих у високорейтингових міжнародних і вітчизняних журналах, які доповідалися на міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях.

Перший блок роботи стосується дослідження і оцінки стану популяцій та визначення їх стратегії. Нами здійснено інтегровані дослідження стану популяцій G. lutea, G. punctata та G. acaulis в Українських Карпатах: визначено площу, щільність, вікову, просторову та віталітетну структури, здатність популяцій до відтворення та самопідтримання; оцінено міжпопуляційну варіабельність морфометричних параметрів; проведено розподіл вивчених популяцій у координатах «дельта-омега» та на основі цих показників встановлено їх стратегію.

Виявлено, що для популяцій G. lutea властиві великі площі (від 3 до 40 га) та щільність (1,9–6,5 ос./м2). G. punctatа та G. acaulis формують переважно малі часткові популяції, щільність яких коливається у межах 0,3–7,2 ос./м2 та 3–11,6 ос./м2 відповідно.

Встановлено, що у сприятливих еколого-географічних умовах та за незначного затінення і задерніння ґрунту переважає дифузне та компактно-дифузне (на периферії) розташування. Посилення затінення і задерніння ґрунту та антропогенне навантаження зумовлюють зміну просторового розташування на компактно-дифузне або компактне. Заростання територій чагарниками спричинює інсуляризацію популяцій та поділ їх на окремі локалітети.

Виявлено, що популяції досліджених видів тирличів є нормальними повночленними з лівостороннім віковим спектром. Винятком є лише субпопуляції G. punctata на г. Ворожеска та G. acaulis на г. Ребра, які є нормальними неповночленними через відсутність ювенільних (г. Ворожеска) та сенільних (г. Ребра) особин. Причиною порушення вікової структури популяцій, очевидно, є вплив антропогенних факторів та затінення і задерніння ґрунту.

Визначено індекси відновлення популяцій, за яким вони є молодими, окрім популяцій на гг. Трояска–Татарука, пол. Крачунєска (G. lutea), г. Ворожеска (G. punctata), г. Говерла (G. acaulis). За класифікацією «дельта-омега» усі популяції є молодими, за винятком субпопуляції G. punctata на г. Ворожеска. Самопідтримання популяцій G. lutea відбувається переважно за рахунок генеративного розмноження, а субпопуляцій G. acaulis – вегетативного. Для часткових популяцій G. punctata такої особливості не виявлено: у трьох субпопуляціях переважає вегетативне розмноження, у двох – генеративне.

За визначеною нами віталітетною структурою популяції у сприятливих умовах середовища є процвітаючими, а вплив випасу, присутність негативних видів-сусідів спричинюють зміну віталітетної структури на рівноважну та депресивну.

На основі аналізу стану популяцій та режиму використання їх ценозів можна припустити, що умови заповідання є сприятливими для збереження місцезростань цих видів. Однак, абсолютне заповідання, особливо в субальпійському поясі, призводить до погіршення світлового режиму та посилення задернування ґрунту, унаслідок чого спостерігається тенденція зникнення світлолюбних видів (Климишин, 2010), до яких належать G. lutea, G. punctata та G. acaulis. Виявлено, що інтенсивний випас худоби, викопування кореневищ (у випадку G. lutea, G. punctata) та надмірна рекреація спричинюють зменшення чисельності популяцій. У той же час, у місцях порушення трав’яного покриву людиною і тваринами спостерігається найбільше скупчення ювенільних особин цих видів, оскільки за таких умов відбувається проростання насіння та розвиток підросту. Очевидно, як інтенсивне пасторальне навантаження, так і абсолютне заповідання, можуть спричинювати тенденцію переходу процвітаючих популяцій у ранг рівноважних та депресивних. Найбільш доцільним для збереження місцезростань G. lutea, G. punctata, G. acaulis, на нашу думку, є заповідання з регульованим використанням.

На основі наведених вище показників, а також враховуючи особливості онтогенезу, здатність захоплювати і утримувати територію, витримувати конкуренцію з іншими видами визначено типи стратегій G. lutea, G. punctata та G. acaulis. Встановлено, що G. lutea є конкурентом, проте у результаті дії випасу, затінення і задерніння ґрунту набуває ознак вторинної конкурентно-стрес-толерантної стратегії, а у результаті порушення суцільного трав'яного покриву – конкурентно-рудеральної. G. punctata та G. acaulis володіють стрес-толерантною стратегією. Однак, у сприятливих умовах G. punctata набуває ознак конкурентно-стрес-толерантної стратегії, а погіршення умов зростання та вплив інтенсивного антропогенного пресингу призводять до згасання популяцій. Досліджені нами субпопуляції G. acaulis володіють стрес-толерантно-рудеральною стратегією.

Визначення стратегії популяцій G. lutea, G. punctata та G. acaulis дало змогу виділити порушені популяції тирличів. Такими місцезростаннями G. lutea серед досліджених нами є: г. Пожижевська, г. Петрос, пол. Крачунєска, гг. Трояска Татарука, г. Ворожеска, пол. Рогнєска; G. punctata – г. Брескул, г. Говерла, г. Татул, г. Ворожеска; G. acaulis – г. Ребра, г. Говерла, г. Петрос. Однак, відновлення популяцій, які піддаються впливу природних негативних чинників (пригнічення тирличів високими чагарниками), а також інтенсивному випасу на г. Ворожеска (популяції G. lutea та G. punctata), пол. Рогнєска (G. lutea) і г. Петрос (G. acaulis), на наш погляд, не дасть бажаного ефекту. Позитивні результати можна отримати під час відновлення популяцій G. lutea на г. Пожижевська, г. Петрос, пол. Крачунєска, гг. Трояска Татарука, субпопуляцій G. punctata на г. Брескул, г. Говерла, г. Татул та G. acaulis на г. Ребра, г. Говерла, оскільки вони піддаються незначному негативному біотичному впливу.

Другий блок роботи присвячено молекулярно-генетичному аналізу популяцій G. lutea. За допомогою ДНК-маркерів досліджено генетичний поліморфізм та охарактеризовано генетичну структуру п’яти природних та однієї інтродукованої популяцій рідкісного виду G. lutea, що знаходяться на двох хребтах (Чорногора, Свидовець) в Українських Карпатах. Сукупне використання п’яти типів молекулярно-генетичних маркерів (RAPD, ISSR, RGAP, CDDP, IRAP) дозволило охарактеризувати поліморфізм різних ділянок геному рослин G. lutea та встановити основі показники генетичної різноманітності. Виявлено, що розмах мінливості популяцій G. lutea знаходиться в межах рівня генетичного поліморфізму, визначеного для інших представників родини Gentianaceae. Встановлено, що розподіл загальної генетичної різноманітності на між- та внутрішньопопуляційну (AMOVA), характеризується значним (приблизно у 2 рази) переважанням міжпопуляційних відмінностей, що є свідченням значної генетичної дивергенції популяцій G. lutea. Усі застосовані молекулярно-генетичні підходи до оцінки диференціації популяцій продемонстрували схожі результати. Така ізоляція популяцій G. lutea, очевидно, існує впродовж тривалого часу і призвела до накопичення суттєвих міжпопуляційних відмінностей.

Не виявлено кореляцій між генетичними та географічними відстанями популяцій G. lutea. Імовірно, це зумовлено тим, що формування генофонду окремих популяцій відбувалось під впливом інших факторів довкілля не залучених до аналізу, або ж було пов’язане з історією утворення самих популяцій. Також не було виявлено зв’язку між показниками генетичної різноманітності популяцій G. lutea та їхньою чисельністю. Головною причиною цього може бути значна тривалість життя окремих особин виду, що уповільнює втрату різноманіття у випадку скорочення чисельності популяції в несприятливих умовах. У той же час, виявлено достовірну негативну високу кореляцію між індексом віковості популяцій і показниками очікуваної гетерозиготності, а також індексом Шеннона (в обох випадках rs = –0,9, p = 0,05). Тобто, із зростанням індексу віковості, який свідчить про старіння популяцій, показники генетичної різноманітності зменшуються, що й підтверджується коефіцієнтом кореляції Спірмена.

У роботі запропоновано і реалізовано підхід (на прикладі G. lutea), який ґрунтується на використанні комплексного аналізу до визначення стану популяцій G. lutea, однією із складових якого є оцінка генетичної структури популяцій та співставлення отриманих результатів із результатами екологічних досліджень. За результатами комплексного аналізу популяції G. lutea були віднесені до трьох груп: стабільні (пол. Лемська, гг. Шешул-Павлик, г. Пожижевська), відносно стабільні (г. Гутин Томнатик), нестабільні (пол. Крачунєска, гг. Трояска-Татарука). Порушення стабільності популяцій спричинене впливом біотичних (затінення високими чагарниками, щільне задерніння ґрунту злаками) та антропогенних (пасторальне навантаження, неконтрольоване викопування кореневищ для потреб народної медицини) факторів. Результати еколого-генетичного аналізу агропопуляції з г. Пожижевська свідчать, що штучні насадження G. lutea у високогір’ї Українських Карпат можуть слугувати одним із способів збереження генофонду цього виду.

Третій блок присвячено дослідженню фізіологічних особливостей тирличів та їх потреб в елементах мінерального живлення з метою використання цих результатів для оптимізації складу живильного середовища під час культивування in vitro. Нами здійснено аналіз на вміст дев’яти макро- та мікроелементів рослин 3 видів та 7 різних популяцій в Українських Карпатах. У ґрунтах досліджених ділянок встановлено високий вміст рухомих форм більшості досліджених макро- та мікроелементів на фоні низьких значень pH. Виявлено відмінності концентрацій більшості елементів між ґрунтами з оселищ одного виду.

Встановлено, що елементний склад рослин та їх органів залежали від видової та популяційної приналежності рослин та елементного складу ґрунтів на яких вони зростали. Визначено коефіцієнти біологічного накопичення елементів рослинами G. lutea, G. acaulis та G. punctata, які варіювали як в різних органах, так і в зразках з різних локалітетів.

У цілому, отримані нами результати свідчать про те, що вміст хімічних елементів у рослинах генетично успадковується і в той же час залежить від їхньої концентрації у ґрунті. Вивчення елементного складу ґрунтів і потреб рослин в елементах мінерального живлення в природних місцях зростання та врахування цих характеристик при вирощуванні рослин в умовах in vitro дозволить підвищити ефективність як мікроклонального розмноження, так і адаптації рослин до природних місць зростання.

Четвертий блок стосується з’ясуванню адаптивних механізмів рослин на клітинному, тканинному та організмовому рівнях до стресових умов штучної біологічної системи – культури in vitro, а також підбору умов для адаптації вирощених in vitro рослин в умови ex vitro. Дослідження проведено на рідкісному високогірному ендемічному виді – G. lutea та рівнинному G. pneumonanthe. Так, досліджували особливості сомаклональної мінливості на цитогенетичному та молекулярно-генетичному рівнях, мінливість рослин, одержаних шляхом прямої регенерації та непрямої регенерації з тривалокультивованої культури тканин, залежність генетичних змін від складу живильного середовища, способу й тривалості вирощування, типу культури. Провели порівняння особливостей і рівня змін у культурі іn vіtro та відмінностей між рослинами з природної популяції.

Показано, що рівень сомаклональної мінливості був різним і залежав від видової та популяційної приналежності рослини-донора. Виявлено, що генетичні дистанції досліджених зразків були більшими у випадку високогірного виду G. lutea і меншими – у рівнинного G. pneumonanthe. Встановлено, що розмах мінливості культури in vitro двох видів тирличів, оцінений з використанням двох типів маркерів, не виходив за межі внутрішньопопуляційного поліморфізму. Рівень генетичних змін був найменшим у рослин-регенерантів, отриманих шляхом прямого органогенезу, найбільшим – у тривало культивованих неморфогенних калюсів та культур ізольованих коренів. Отримані результати молекулярно-генетичного аналізу свідчать про відносну генетичну стабільність геномів G. pneumonanthe та G. lutea при вирощуванні in vitro і дають підстави для використання отриманих культур тканин і органів з метою збереження генофонду цих видів.

Проведено дослідження онтогенезу G. lutea, G. punctata та G. acaulis in vitro: проаналізовано міжпопуляційні відмінності протікання онтогенезу G. lutea та G. acaulis, особливості індивідуального розвитку особин G. lutea in vitro та in situ; виявлено відмінності онтогенезу G. punctatа та G. lutea. Розроблено методику адаптації отриманих in vitro рослин G. lutea до умов ex vitro, яка включала підбір складу живильного середовища для вкорінення рослин, розробку схеми адаптації цих рослин до вирощування у ґрунті; репатріацію адаптованих до умов ex vitro рослин G. lutea в умови in situ.

Для вкорінення рослин G. lutea in vitro найбільш оптимальним серед протестованих виявилося середовище МС/2 з половинним вмістом NH4NO3 без вітамінів та сахарози, доповнене 3 г/л маніту та 0,05 мг/л Кін з використанням у якості підтримуючого субстрату агару (4 г/л) у поєднанні з перлітом (16 г/л). Також ефективним було поетапне зменшення у живильному середовищі (МС/2 без вітамінів та із зменшеним вмістом NH4NO3) концентрації цукрів з 10 г/л до 2 г/л із наступним вкоріненням цих рослин у водопровідній воді.

Результати адаптації та приживання висаджених у ґрунт рослин, які були вкорінені у водопровідній воді та у живильному середовищі, практично не відрізнялися. Тому для вкорінення G. lutea та подальшої акліматизації їх до умов ex vitro, можна використовувати ці два варіанти. Частка адаптованих до умов in situ рослин становила 51 %. Відсоток адаптованих до умов in situ життєздатних рослин G. lutea є вищими у 2 рази порівняно з результатами М. Петрової із співавторами (Petrova et al., 2011) та у 1,4 рази – порівняно з результатами, отриманими раніше співробітниками лабораторії екології та біотехнології ТНПУ імені Володимира Гнатюка (Страшнюк та ін., 2007). Це свідчить про ефективність та доцільність поєднання еколого-фізіологічних, молекулярно-генетичних та біотехнологічних досліджень при розробці підходу до поновлення природних популяцій тирличів і, очевидно, інших рідкісних видів рослин.

Практична значимість. Окрім фундаментального значення, робота має важливе практичне значення, оскільки в ній обґрунтовується та пропонується спосіб збереження рідкісних видів тирличів шляхом поновлення їх порушених популяцій.

Комплексне вивчення природних популяцій тирличів (вікової, просторової, віталітетної структур, здатності до самовідновлення та самопідтримання, визначення стратегії, рівня внутрішньопопуляційного та внутрішньовидового поліморфізму, ступеня диференціації популяцій) дозволить встановити доцільність та перспективність їхнього відновлення, а також дасть змогу виділити модельні популяції, які буде використано для стабілізації чисельності особин.

Оцінка стану популяцій у різних умовах (абсолютне заповідання у Карпатському національному природному парку (КНПП), помірний та інтенсивний антропогенний пресинг) показала, що найбільш оптимальним для розвитку та відновлення популяцій G. lutea, G. punctata та G. acaulis є заповідання з регульованим використанням. Такий підхід може бути використано природоохоронними установами (КНПП, Карпатським біосферним заповідником) для збереження та охорони тирличів, а також видів, близьких до тирличів за біоекологічними особливостями.

Наукові висновки роботи і рекомендації можуть бути використані для проведення моніторингу популяцій тирличів. Одночасне застосування різних типів ДНК-маркерів для молекулярно-генетичного аналізу відкриває нові можливості вивчення організації та функціонування геномів рідкісних і зникаючих видів рослин шляхом їх мультилокусного маркування. Розроблена для G. lutea система молекулярно-генетичних маркерів може бути використана для оцінки генетичного поліморфізму популяцій цього виду. Вивчення генетичної різноманітності популяцій, оцінка їх стану дозволяє рекомендувати науково обґрунтовані заходи збереження тирличів. Результати дослідження можуть бути використані під час інтродукції або реінтродукції з метою збереження популяцій тирличів.

Авторами також розроблені технології тривалого неорганізованого росту культури тканин, прямої і непрямої регенерації, отримання швидкоростучої культури ізольованих коренів тирличів, які можуть бути використані для збереження і прискореного розмноження цінних генотипів. Висока ефективність прямого органогенезу та збереження здатності калюсних культур до морфогенезу впродовж порівняно тривалого часу (до 1 року) дає можливість використання цих методів культивування in vitro для отримання достатньої кількості рослинного матеріалу тирличів. Розроблений та запатентований спосіб двоетапного отримання та вирощування швидкоростучої культури ізольованих коренів відкриває перспективи її використання як джерела сировини для фармацевтики.

Підібрано склад живильних середовищ та умови вирощування, які у комплексі забезпечують низький рівень геномних змін у культурі тканин та органів, і, таким чином, створюють передумови їхнього використання для збереження генофонду рідкісних лікарських видів роду Gentiana. Запропонований підхід оцінки рівня генетичної мінливості/cтабільності культур in vitro тирличів за допомогою RAPD- та ISSR-маркерів може бути застосований і для інших рослин. Результати можуть використовуватися у науково-дослідницькій практиці для розробки методології отримання та вивчення культури тканин інших цінних лікарських рослин.

Комплексний підхід до вирішення проблеми оптимізації складу живильного середовища для вирощування рослин G. lutea, G. acaulis та G. рunctata, який включає дослідження вмісту макро- та мікроелементів у ґрунтах з природних місцезростань тирличів, вивчення елементного складу різних органів цих рослин, їхніх потреб в елементах мінерального живлення, дозволить забезпечити інтенсивний ріст рослин in vitro, а також полегшить процес їх адаптації до умов ex vitro та in situ.

Розроблений та запатентований нами спосіб збереження G. lutea з використанням біотехнологічних методів, який включає: вкорінення мікроклонально розмножених рослин G. lutea in vitro, перенесення вкорінених рослин в умови ех vitro, а відтак – in situ, дозволив зменшити, порівняно із відомим способом (Petrova et al., 2011), матеріальні витрати завдяки використанню живильних середовищ без вітамінів, із зниженим у 7–10 разів вмістом цукрів, а також частковій заміні підтримуючого субстрату агару на дешевший у 20–25 разів перліт; підвищити відсоток укорінення in vitro рослин до 94–97 % та збільшити кількість адаптованих до умов ex vitro рослин до 71–72 %.

Запропонована та апробована нами технологія вирощування рослин тирличів in vitro на оптимізованих живильних середовищах дозволить отримати достатню кількість життєздатних вкорінених рослин з високою адаптивною здатністю до умов ex vitro та in situ, які уже можуть бути використані для відновлення чисельності порушених популяцій тирличів в Українських Карпатах та збереження генофонду цих рідкісних видів. Отримані результати можуть бути використані у науково-дослідницькій практиці для розробки методології оптимізації умов вирощування in vitro та адаптації до умов ex vitro та in situ інших цінних рідкісних видів рослин.

Відпрацьовані нами технології дозволять поновити знищені та порушені популяції тирличів в Українських Карпатах. Розпочато впровадження цих розробок з адміністраціями Карпатського національного природного парку, Карпатського біосферного заповідника, а також з Інститутом екології Карпат НАН України – на високогірному біологічному стаціонарі «Пожижевська». Розробка використовується у науково-дослідних роботах Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, спрямованих на отримання та вкорінення рослин-регенерантів in vitro, адаптації їх до умов ex vitro з метою наступних молекулярно-генетичних і фізіологічних досліджень в умовах відкритого ґрунту.

Отримані дані використовуються у навчальних курсах «Біологічні основи охорони природи», «Біотехнологія та генна інженерія» «Загальна екологія», «Популяційна біологія», «Фізіологія рослин», «Генетика» і «Молекулярна генетика» для студентів та магістрантів хіміко-біологічного факультету ТНПУ ім. В. Гнатюка, а також можуть бути використані у навчальному процесі для студентів і магістрантів інших вищих навчальних закладів.

Подібний цикл наукових робіт виконаний вперше та є пріоритетним не лише для української, а й для світової науки.



Публікації. Дослідження виконано з використанням сучасних методів; результати роботи опубліковані у високорейтингових міжнародних журналах та доповідалися на міжнародних та всеукраїнських наукових конференціях. Результати роботи відображено в розділі монографії (видавництво Springer), 70 наукових публікаціях, а саме: 30 статтях, з них 8 у міжнародних журналах із сумарним імпакт-фактором 3,609, з яких згідно баз даних Scopus реферовані 4; 38 тезах доповідей на наукових конференціях, у тому числі 24 міжнародних. Авторами отримано 2 патенти України на корисну модель. Роботи авторів процитовано 48, сумарний індекс цитувань – 8, h-індекс (SciVerse Scopus) – 3.
Майорова О.Ю.

Мосула М.З.

Конвалюк І.І.

Твардовська М.О.





База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка