М изучением отдельных предметов Исследовательский проект Активность каталазы -простейший тест на ксенобиотики




Скачати 371.82 Kb.
Сторінка1/3
Дата конвертації18.04.2016
Розмір371.82 Kb.
  1   2   3
МОУ СОШ № 13

с углубленным изучением отдельных предметов

Исследовательский проект

Активность каталазы –простейший тест на ксенобиотики



j0437380.jpg

Выполнил: ученик 11класса Царев Владислав

Руководитель: учитель биологии О.П. Жмаева

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Введение._______________________________________________ 1

Глава I. Активность каталазы растений как индикаторный

признак при биотестировании. __________________________ 3

I - 1. Биотестирование._____________________________________ 4

I - 2. Биоиндикация._______________________________________ 6

I - 3. Ферменты – биологические катализаторы._______________ 8

I - 4. Каталаза – чемпион катализа. __________________________ 12

I - 5. Методы определения активности каталазы.______________ 14

I – 6. Единицы измерения активности каталазы.______________ 18

Глава II. Корреляционный анализ взаимосвязи активности

каталазы и степени загрязнения среды обитания. _____ 20
II – 1. Исследование активности каталазы в листьях однолетних

декоративных растений в условиях городской среды._____ 21

II – 2. Определение активности каталазы сырого картофеля при

воздействии среды разной степени загрязнения. _______ 24
II – 3. Определение активности каталазы в проростках фасоли,

выращенных на средах с разной степенью загрязнения.____27

Глава III. Заключение.________________________________________32
Глава IY.Информационные источники._________________________34
Введение.

Ежегодно в мире разрабатываются и затем производятся десятки новых веществ, не свойственных живой природе, совершенно невозможно предугадать их токсическое воздействие на окружающий мир и человека. Поэтому особо остро встают вопросы комплексного изучения экологии окружающей среды. Исследование влияния различных химических соединений на биологические молекулы, в том числе на ферменты, весьма актуальны в настоящее время, поскольку они дают возможность выявить новые тест-функции для мониторинга окружающей среды.



Цель работы:

определение токсичности техногенных зон микрорайона школы с различным по интенсивности автотранспортным воздействием методом исследования активности каталазы в тканях растений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие Задачи:



  • изучение различных методов биотестирования с помощью изменения активности ферментов;

  • модернизация прибора Лишкевича с учетом технических возможностей школьной лаборатории;

  • исследование устойчивости декоративных растений на загрязнение окружающей среды с помощью простейшего биотеста – изменения активности каталазы в проростках растений;

  • определение активности каталазы в проростках фасоли, выращенных на средах с разной степенью загрязнения;

  • исследование зависимости активности каталазы сырого картофеля

от степени загрязнения снега выбросами автотранспорта;

Гипотеза.

Если активность каталазы в тканях организмов снижается, то это может служить показателем степени загрязнения окружающей среды ксенобиотиками.

Объект исследования:

процесс разработки простейшего метода биотестирования токсичности зон микрорайона школы с различной грузонапряженностью.



Предмет исследования:

фермент каталаза в тканях растений.



Методы исследования.

Активность каталазы определяется газометрическим методом Лишкевича

(http://www,gjjgle.com/int/ru/options/spase/физиология растений)

К навеске исследуемого растения прибавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают и выливают в колбочку прибора Лишкевича. Двумя миллилитрами воды ополаскивают ступку и жидкость выливают в колбочку прибора. Добавляется на кончике совочка мел. В тигелек наливают 2 мл 2%-ной перекиси водорода, нейтрализованной 3 каплями 0,1 н NaOH. Тигелек при помощи пинцета устанавливают на дно колбочки. Колбочку плотно закрывают пробкой, которая резиновой трубкой через тройник соединяется с уравнительным сосудом.

Через отверстие в уравнительном сосуде наливают воду до нулевого деления бюретки и выходное отверстие каучуковой трубки тройника закрывают зажимом. Далее обязательно проверяют прибор на герметичность. Для этого уравнительный сосуд опускают вниз и фиксируют в одном положении. Уровень воды в бюретке также должен быть в одном положении. В противном случае устраняют неисправность.

Держа мениски воды нулевого деления бюретки и уравнительного сосуда на одном уровне, опрокидывают тигелек с перекисью водорода в колбочку и в течение 4 минут легонько встряхивают колбочку. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой по мере увеличения количества газа начинает опускаться.

Количество выделившегося кислорода отмечают каждую минуту, причем в момент отсчета уровень воды в уравнительном сосуде устанавливают точно по уровню в бюретке. Опыт повторяют 2 – 3 раза, высчитывают среднее арифметическое. Активность каталазы выражается величиной, равной объему воды, вытесненной кислородом за единицу времени.





Биотестирование, как правило, используют до химического анализа, т.к. этот метод позволяет провести экспресс-оценку природной среды и выявить"горячие точки", указывающие на наиболее загрязненные участки территории. На участках, где методами биотестирования выявлены какие-либо отклонения и исследуемая среда характеризуется как токсичная, аналитическим путем необходимо установить причины этого явления.

Использование активности каталазы проростков тест-растений в качестве чувствительного критерия для биотестирования загрязнения окружающей является перспективным методом экологического мониторинга.



Глава I.

Активность каталазы растений как индикаторный признак при биотестировании.


j0413636.wmf


I – 1 . Биотестирование

Под биотестированием (англ. bioassay) обычно понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов. Благодаря простоте, оперативности и доступности биотестирование получило широкое признание во всем мире и его все чаще используют наряду с методами аналитической химии. Существует 2 вида биотестирования: морфофизиологический и хемотаксический. Хемотаксический метод более точный, так как в нем используется специальный прибор, а морфофизиологический позволяет более точно описать, что происходит с тест-объектами.

Тест-объект (test organism) - организм, используемый при оценке токсичности химических веществ, природных и сточных вод, почв, донных отложений, кормов и др. Тест-объекты, по определению Л.П.Брагинского - "датчики" сигнальной информации о токсичности среды и заменители сложных химических анализов, позволяющие оперативно констатировать факт токсичности (ядовитости, вредности) среды ("да" или "нет"), независимо от того, обусловлена ли она наличием одного точно определяемого аналитически вещества или целого комплекса аналитически не определяемых веществ.

Жизненная функция или критерий токсичности (toxicity criterion), используемые в биотестировании для характеристики отклика

тест-объекта на повреждающее действие среды.Тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:

для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых - выживаемость (смертность) тест-организмов;

для ракообразных, рыб, моллюсков - плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток;

для культур одноклеточных водорослей и инфузорий - гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры;

для растений - энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.

Биомаркеры – это организмы и их характеристики, которые позволяют  диагностировать текущее состояние  окружающей среды. В качестве характеристик могут выступать физиологические, биохимические, иммунологические  и другие свойства (процессы) организмов.
Биотестирование, как правило, используют до химического анализа, т.к. этот метод позволяет провести экспресс-оценку природной среды и выявить "горячие точки", указывающие на наиболее загрязненные участки акватории (территории, полигона). На участках, где методами биотестирования выявлены какие-либо отклонения и исследуемая среда характеризуется как токсичная, аналитическим путем необходимо установить причины этого явления.

Биотестирование не дает ответа на вопрос о характере загрязняющего вещества, вызывавшего ту или иную реакцию тест-объекта. Тест-функции в биотестировании носят общий, неспецифический характер. Однако количество загрязняющих веществ, попадающих в окружающую среду, неуклонно возрастает и не исключено, что какое-либо вещество, или смесь веществ, может привести к возникновению специфических реакций у тест-объектов, особенно на клеточном или тканевом уровнях организации.

На наиболее загрязненных территориях тест-объекты демонстрируют минимальную выживаемость (плодовитость) в тестируемых средах, на основании чего делается вывод об острой (хронической) токсичности тестируемой среды. Токсикометрические показатели, используемые в биотестиоровании, позволяют картировать загрязненные районы.

I – 2. Биоиндикация

Биоиндикация  (bioindication) – метод определения качества среды обитания организмов  по видовому составу и показателям количественного развития видов биоиндикаторов и структуре образуемых ими сообществ.

Биоиндикатор (bioindicator) – организм, вид, популяция, сообщество, характеризующиеся специфическими особенностями обитания или указывающие на специфические изменения условий среды (Семенченко, 2004). 

Биоиндикаторы делят на следующие группы:



  • индивидуальные: размер особей, плодовитость, наличие аномальных особей и т.д.;

  • процессы: увеличение или уменьшение скоростей процесса (например, скорости фотосинтеза);

  • структурные: видовая структура, число толерантных (интолерантных видов), биотические индексы и т.д.;

  • экосистемные:  видовое разнообразие, видовая структура (Семенченко, 2004).

Биоиндикаторы загрязнения (bioindicators of contamonation)  -

1)  организмы, которые поглощают (накапливают) токсические вещества и способны  в силу этого быть показателями загрязненности  воды данным веществом;

2) организмы, свидетельствующие о загрязненности среды. По набору таких организмов в водоеме  судят о качестве воды (Кузьменко и др., 1999).  
В отличие от биомаркеров, биоиндикаторы не могут мгновенно реагировать на изменение экологических условий, т.к. их индикаторными свойствами являются  популяционные процессы и процессы в сообществе в целом.

Основным преимуществом биоиндикаторов перед биомаркерами является тот факт, что далеко не всегда кратковременное изменение условий, на которое реагирует биомаркеры, приводит к негативным изменениям в популяциях, сообществах и экосистемах (Семенченко, 2004).

Основой задачей биоиндикации является разработка методов и критериев, которые могли бы адекватно отражать уровень антропогенных воздействий с учетом комплексного характера загрязнения и диагностировать ранние нарушения в наиболее чувствительных компонентах биотических сообществ. Биоиндикация, как и мониторинг, осуществляется
на различных уровнях организации биосферы: макромолекулы, клетки, органа, организма, популяции, биоценоза. Очевидно, что сложность живой материи и характера ее взаимодействия с внешними факторами возрастает по мере повышения уровня организации. В этом процессе биоиндикация на низших уровнях организации должна диалектически включаться в биоиндикацию на более высоких уровнях, где она предстает в новом качестве и может служить для объяснения динамики более высокоорганизованной системы.
Считается, что использование метода биоиндикации позволяет решать задачи экологического мониторинга в тех случаях, когда совокупность факторов антропогенного давления на биоценозы трудно или неудобно измерять непосредственно.

Хорошие результаты дает анализ бентосных (придонных) беспозвоночных. Оценка чистоты водоемов делается по преобладанию, либо отсутствию тех или иных таксонов.

Ностак сливовидный является хорошим биоиндикатором. Наличие этого вида говорит о чистой воде. Первый признак тревоги - измельчение и нарушение правильной округлой формы изумрудных "шаров" этой водоросли.

♦ Бурное развитие других сине-зеленых водорослей, например, осциллятории - хороший индикатор опасного загрязнения воды органическими соединениями.

Трубочник образует огромные скопления в илу сильно загрязненных рек, в незначительных количествах встречаются также на песчаных и каменистых грунтах более чистых рек.

Мотыль образует большие скопления в силу сильно загрязненных органическим веществом рек.

Крыска (эриталис) - это личинка мухи - пчеловидки из семейства журчалок. Крыска обитает в загрязненных органическим веществом водоемах с черным илом и сильным запахом сероводорода.
Таким образом, биоиндикацию можно определить как совокупность методов и критериев, предназначенных для поиска информативных компонентов экосистем, которые могли бы:


  • адекватно отражать уровень воздействия среды, включая комплексный характер загрязнения с учетом явлений синергизма действующих факторов;

  • диагностировать ранние нарушения в наиболее чувствительных компонентах биотических сообществ и оценивать их значимость для всей экосистемы в ближайшем и отдаленном будущем.


I-3. Ферменты – биологические катализаторы .
Термин “фермент” (от лат. fermentum – закваска) был предложен в начале XVII века голландским ученым Ван Гельмондом.

Почти все ферменты являются белками (но не все белки – ферменты). Представление о том, что ферменты – белки утвердилось не сразу. Для этого надо было научиться их выделять в высоко кристаллической форме. Впервые ферменты в такой форме выделил в 1926 году Дж. Самнер. После этого потребовалось еще 10 лет, в течение которых было получено еще несколько ферментов в кристаллической форме, чтобы представление о белковой природе ферментов стало доказанным и получило всеобщее признание.



Классификация ферментов

В 1961 году специальной комиссией международного биохимического союза была предложена систематическая номенклатура ферментов. Ферменты были подразделены на 6 групп в соответствии с общим типом реакции, которую они катализируют. Каждый фермент получил систематическое наименование, точно описывающее катализируемую им реакцию. Однако, поскольку многие из этих систематических названий оказались очень длинными и сложными, каждому ферменту было присвоено рабочее название для повседневного употребления.

Рабочее название складывалось из названия субстрата, типа катализируемой реакции и окончания аза.


Группа

Катализируемая реакция

Оксидоредуктазы. 480 ферментов, большая роль в энергетических процессах

Катализирует реакции окисления – восстановления, перенос атомов H и O или электронов от одного к другому.

Трансферазы

Перенос определенных группы атомов от одного вещества к другому

Гидролазы. 460 ферментов, к ним относятся пищеварительные ферменты, входящие в состав лизосом и других органоидов, где они способствуют распаду более крупных биомолекул на простые

Реакции гидролиза, при которых из субстрата образуются два продукта.

Лиазы. 230 ферментов, участвующих в регуляциях синтеза и распада промежуточных продуктов обмена

Ферменты, катализируемые реакции разрыва связей, в субстрате без присоединения воды или окисления.

Изомеразы. 80 ферментов

Ферменты, катализирующие превращения в пределах одной молекулы, они вызывают внутримолекулярные перестройки.

Лигазы (синтетазы) (около 80 ферментов)

Катализируемое соединение 2-х молекул с использованием энергии фосфатной связи, сопряжено с распадом АТФ.

По особенностям строения молекул можно разделить на 2 группы: простые белки и сложные белки.

У сложных ферментов помимо белковой части имеется добавочная группа небелковой природы – кофактор, например, многие витамины.

строение фермента.gif

Рис. 1 Строение фермента

В молекуле однокомпонентного белка выделяют особую часть, представляющую собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, располагающихся в определенной части белковой молекулы. Ее называют активным центром фермента, который взаимодействует с молекулой субстрата с образованием фермент-субстратного комплекса. Затем фермент-субстратный комплекс распадается на фермент и продукт (продукты) реакции.



работа фермента.jpg

Рис.2 Схема работы фермента.

Согласно гипотезе, выдвинутой Э. Фишером, субстрат подходит к ферменту, как ключ к замку, т.е. пространственные конфигурации активного центра фермента и субстрата точно соответствуют друг другу. Субстрат сравниваем с “ключом”, который подходит к “замку” – ферменту.

Поскольку все ферменты являются белками, их активность наиболее велика при физиологически нормальных условиях:


    1. Большинство ферментов наиболее активно работает только при определенной температуре. При повышении температуры до некоторого значения (в среднем до 50о С) каталитическая активность растет (на каждые 10о С скорость реакции повышается примерно в 2 раза). При t выше 50о С белок подвергается денатурации и активность фермента падает.

    2. Кроме того, для каждого фермента существует оптимальное значение pH, при котором он проявляет максимальную активность.

    3. На скорость реакции влияет также концентрация субстрата и концентрация фермента.

Все ферменты высокоспецифичны к своему субстрату и как правило, катализируют только одну вполне определенную реакцию.

Ферменты получили широкое применение в легкой, пищевой и химической промышленности, а также в медицинской практике.

В пищевой промышленности ферменты используют при приготовлении безалкогольных напитков, сыров, консервов, колбас, копченостей.

В животноводстве ферменты используют при приготовлении кормов.

Ферменты используют при изготовлении фотоматериалов.

Ферменты используют при обработке овса и конопли.

Ферменты используют для смягчения кожи в кожевенной промышленности.

Ферменты входят в состав стиральных порошков, зубных паст.

В медицине ферменты имеют диагностическое значение – определение отдельных ферментов в клетке помогает распознаванию природы заболевания (например вирусный гепатит – по активности фермента в плазме крови) их используют для замещения недостающего фермента в организме.

I - 4. Каталаза – чемпион катализа.

catalase-1dgf.png

Рис. 3. Модель молекулы каталазы

Катала́за - гемсодержащий фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий разложение перекиси водорода с образованием кислорода и воды; широко распространена в тканях животных и растений.

Н2О2 + Н2О2 = О2 + 2Н2О.

Каталаза представляет собой гемопротеин, простетической группой которого является гем, содержащий ион трехвалентного железа. Молекула каталзы состоит из четырех, по-видимому, идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 000 и имеет соответственно четыре простетические группы. Феррипротопорфириновые группы гема прочно связаны с белковой частью фермента — апофермектом и не отделяются от него при диализе. Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале значений 6,0—8,0.

Процесс окисления с помощью цитохромов дает побочный продукт, в больших концентрациях губительный для всего живого,— перекись водорода. Совершенно ясно, что организм нужно защитить от этого крайне опасного соединения. Такая защита есть. Это фермент каталаза. Биологическая роль каталазы заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода. Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза локализуется в специальных органеллах — пероксисомах.

Открытие каталазы также связано с перекисью водорода. Еще Луи Тенар, который, как мы знаем, занимался каталитическим разложением аммиака, открыл перекись водорода в 1818 году и заметил каталитическую активность по отношению к этому веществу животных тканей. Но только в 1907 году было установлено, что в этом повинен фермент, который и назвали каталазой. В кристаллическом виде получить ее удалось только через 30 лет из печени быка. Это один из наиболее активных ферментов, молекула которого разлагает в секунду 6 миллионов молекул перекиси водорода. Но что интересно, когда концентрация перекиси водорода становится незначительной, каталаза начинает катализировать реакцию окисления перекисью водорода спиртов, формальдегидов и нитратов. Ферменту простаивать нельзя!

Есть еще один фермент, содержащий железо, который также катализирует реакцию разложения перекиси водорода, это пероксидаза, открытая в самом начале нашего века. Она содержится в слюне, в соке поджелудочной железы, в печени, почках и в лейкоцитах. Имеются сведения, что в плазме крови присутствует особая пероксидаза, которая способствует реакциям некоторых производных перекиси водорода. Особенно богаты пероксидазой сок фигового дерева и корень хрена. И вообще следует заметить, что этот фермент широко распространен в живой природе.

С каталазой и пероксидазой связывают надежды на получение высокоэффективных препаратов для лечения злокачественных опухолей, так как полагают, что эти ферменты играют важную роль в росте клеток.


  1   2   3


База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка