Навчально-методичний посібник «мікробіологія з основами вірусології»




Сторінка2/6
Дата конвертації14.04.2016
Розмір1.25 Mb.
1   2   3   4   5   6
Тема: ФАРБУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ ЗА ГРАМОМ. МЕХАНІЗМ РУХУ БАКТЕРІЙ. РІСТ І РОЗМНОЖЕННЯ БАКТЕРІЙ.
Мета: сформувати поняття про ріст і розмноження бактерій. Вивчити особливості процесу спороутворення та з’ясувати його біологічний зміст; навчитись фарбувати бактерії за Грамом, готувати препарати "висячої” та "роздавленої" краплі, мікроскопувати їх; розвинути навички приготування постійних препаратів бактерій та роботи з мікробіологічними об’єктами; виховувати санітарно-гігієнічні навички. (4 години)
ПИТАННЯ ДЛЯ САМОПІДГОТОВКИ

      1. Охарактеризуйте хімічний склад бактеріальної клітини.

  1. Якими особливостями клітинної оболонки зумовлене різне зафарбування бактерій за Грамом?

  2. Дайте визначення поняття „ріст бактеріальної клітини”. Схема росту бактеріальної клітини.

  3. Механізм руху бактерій. Будова джгутика. Типи джгутикування.

  4. Особливості проходження клітинного циклу. Брунькування деяких видів бактерій.

  5. Процес спороутворення у бактерій, його значення, стійкість спор щодо несприятливих факторів середовища. Значення спороутворення.

  6. Форми і розміщення спор. Проростання спор, його типи.

  7. Спеціалізовані клітинні структури: екзоспори, ендоспори. цисти, конідії.


Теоретична частина

    1. Особливості фарбування клітинної оболонки за Грамом.

    2. Типи руху бактерій. Таксиси у прокаріотів.

    3. Бактерії – рекордсмени клітинного поділу.

    4. Стадії спороутворення.

1. Особливості фарбування клітинної оболонки за Грамом.

До складних методів належить фарбування мікроорганізмів за Грамом. Цей метод застосовується переважно з діагностичною метою. За цим методом усі мікроби поділяються на дві групи: грам-позитивні, які набувають синьо-фіолетового кольору, і грам-негативні, які внаслідок того ж фарбування знебарвлюються при додаванні спирту, а при дофарбовуванні фуксином отримують рожевий колір.

Вважають, що здатність бактерій фарбуватися за Грамом пов’язана з молекулярною організацією і хімічним складом їхньої клітинної оболонки. Проте результати фарбування за Грамом також залежать і від техніки виготовлення мазка (він повинен бути тонким), віку досліджуваної культури і тривалості фарбування.

Для фарбування за Грамом доцільно на одному предметному склі поряд з мазком із досліджуваної культури робити мазок із відомих грам - позитивних і грам-негативних мікробів (для контролю). До найпоширеніших грам-позитивних мікроорганізмів належать майже всі кулясті бактерії, молочнокислі бактерії, спороносні бацили, дріжджі та багато інших. До грам-негативних – азотобактер, оцтовокислі бактерії, кишкова паличка, протей, чудесна паличка, спірохети.

2. Типи руху бактерій. Таксиси у прокаріотів.

Існують два типи рухливих бактерій: повзаючі й плаваючі. До перших належать міксобактерії, ціанобактерії, сіркобактерії та інші. Вони можуть пересуватися по твердому субстрату за допомогою ковзаючого руху. В оболонці цих бактерій виявлено білкові фібрили, які подібні до ниток джгутика. Обертання цих фібрил викликає хвилеподібні рухи клітинної оболонки, за рахунок яких клітина відштовхується від поверхні твердого субстрату. Спірохеті властивий обертальний тип руху. Між протоплазматичним циліндром і оболонкою, яка складається з пептидоглікаду та зовнішньої мембрани, у спірохет виявлені осьові фібрили, що утворюють аксо стиль, ці фібрили є аналогом джгутика.

Характер руху бактерій, що плавають, залежить від кількості і розміщення джгутиків, віку, властивості культури, температури та інших чинників. Окремі види бактерій можуть рухатися за сприятливих умов із швидкістю, яка перевищує довжину їхнього тіла в 50 разів. Наприклад, холерний вібріон може пересуватися із швидкістю 200 мкм за секунду при довжині тіла 3 мкм.

Серед бактерій спостерігаються направлені рухи – таксиси, зумовлені дією різних зовнішніх факторів. Розрізняють такі види таксисів: хемотаксис, фототаксис, термотаксис, магнітотаксис, віскозотаксис і аеротаксис. Кожен із їхніх рухів може бути позитивним або негативним. У зв’язку з погіршенням екологічної ситуації, особливу увагу нині привертає вивчення хемотаксису мікроорганізмів. До цього виду руху відносяться також осмотаксис, який зумовлюється концентрацією солей, та аеротаксис, спричинюваний киснем.

3.Бактерії – рекордсмени клітинного поділу.

Згідно однієї давньої індійської легенди, могутній брахманський властелін Шерам обіцяв своєму візиру Зессу ібн Дахеру, винахіднику гри в шахи, виконати його будь-яке його бажання. Мудрець попрохав розмістити пшеницю, в такій кількості, якщо на першу із 64 клітинок шахової дошки покласти 1 пшеничне зерно, на другу – 2, на третю – 4, на четверту – 8, тобто на кожну наступну клітинку потрібно класти подвійне число. Цар був дуже здивований цим смішним проханням і наказав принести мішок пшениці. Але його здивування все збільшувалося з часом, оскільки, вміст мішка швидко вичерпувався, а незаповнених клітинок залишалося багато. Остаточний розрахунок показав, що для заповнення однієї лише64 клітинки потрібно було б 18,5 трильйонів зерен. Такою кількістю можна було б засипати всю Землю шаром в один сантиметр.

Таку ж безмежну кількість бактерій можна отримати, якщо підрахувати скільки мікроорганізмів може утворити одна – єдина клітина. Бактерії – це рекордсмени клітинного поділу: в залежності від умов та бактеріального виду необхідно від декількох хвилин до години для того, щоб клітина бактерії утворила перетяжку. Якщо взяти до уваги, що одна бактеріальна клітина ділиться кожні 20 хвилин у середньому, то, відповідно, через 20 хвилин утворюється дві дочірніх бактерії, через 40 хвилин – 4 внучки, через 60 хвилин 8 правнуків, через 80 хвилин – 16 праправнуків. Отже, всього лише через 10 годин 40 хвилин із однієї бактеріальної клітини виникло б понад 4 мільярди нащадків, тобто, через неповні дві доби безперешкодного розмноження одна бактерія масою, що складає лише 0,000000000001 г зуміла б утворити кількість нащадків маса яких відповідала масі б нашої планети (близько 6000 000 000 000 000 000 000 тонн). Але, на щастя, справа не доходить до того, щоб наша Земля повністю «заросла» бактеріями. Для того, щоб мікроби змогли швидко розмножуватися, їм необхідна достатня кількість їжі, сприятливі умови існування, подібні до тих, які штучно створюються в біореакторі. Отже, мікроби надзвичайно продуктивні. У той же час, одна корова із живою масою 500 кг утворює за добу 0,5 кг білку. Рослина сої продукує за той же період 5 кг. А рівна маса дріжджів здатна виробляти у біореакторі за добу 500 тон білку, що в 100 разів перевищує її власну масу і приблизно дорівнює масі 10 дорослих слонів.

У сприятливих умовах мікробна клітина здатна продукувати 100000 більше білку, ніж тваринна. При цьому вона використовує дешеві речовини, наприклад, крохмальні розчини або навіть стічні води.

4. Стадії спороутворення.

У представників багатьох родів, наприклад Clostridium Bacillus та інших, у середині клітини утворюються округлі та еліптичні тільця, що називаються спорами, а тому спороутворення у бактерій розглядається як засіб розмноження. Процес спороутворення може тривати у кожній клітині від кількох годин до доби. На утворення спори витрачається більша частина протоплазми. Найкраще спороутворення вивчено у представників родів Clostridium Bacillus. Коли бацила потрапляє в умови, які зумовлюють утворення спори в декілька стадій:

На першій стадії відбувається утворення спори нуклеоїд вегетативної набуває форми видовженого тяжа, що проходить у здовж довгої осі клітини. На цій стадії припиняється реплікація ДНК, відбувається перебудова білків.

На другій стадії з осьового тяжа виокремлюються дві частини: мала – неклеоїд майбутньої спори і велика – неклеоїд клітини, в якій утворюється ця спора. Цей поділ супроводжується появою перегородки внаслідок інвагінації цитоплазматичної мембрани.

На третій стадії мембрана більшої клітини разом з цитоплазмою оточують меншу клітину, утворюється овальної форми проспора, оточена двома мембранами – зовнішньою і внутрішньою. Проспора відділяється від мембрани материнської клітини.

Четверта стадія утворення спори характеризується утворенням специфічної оболонки спори – кортекса, що формується між мембранами проспори.

На п’ятій стадії формуються покриви спори, що складаються з кількох шарів різної товщини і будови у різних видів бактерій.

На шостій стадії завершується дозрівання спор, яке супроводжується синтезом особливої сполуки – дипіколінової кислоти. На цій стадії набуває властивості високої стійкості до температури, висушування, хімічних речовин.

Потрапляючи у сприятливі умови, спои проростають і перетворюються на вегетативні клітини. Проростання починається з інтенсивного поглинання спорою види та її набухання.


Практична частина

Завдання 1. Замалювати та підписати будову джгутика та типи джгутикування бактеріальної клітини

Рис. 2.1. Будова джгутика бактеріальної клітини

1. нитка, 2. гачок, 3. базальна частина, 4. стержень, 5. L кільце,

6. P кільце, 7. S кільце, 8. М кільце, 9. ЦПМ, 10.



Рис. 2.2. Типи джгути кування бактеріальної клітини.


Завдання 2. Зобразити у вигляді графіку схему росту бактеріальної культури.

Рис. 2.3. Схема росту бактеріальної культури:

N – кількість клітин (млн у / мл); 1g N – те саме в логарифмічному виразі; І – лаг-фаза; ІІ – експоненціальна фаза; ІІІ – фаза сповільнення росту; IV – максимальна стаціонарна фаза; V – фаза відмирання
Завдання 3. Заповнити таблицю «Порівняльна характеристика грамозитивних та гарам негативних мікроорганізмів»

Порівняльна характеристика Гр.+ та Гр.  мікроорганізмів





Грам позитивні мікроорганізми

Грам не гативні мікроорганізми

1.







2.







3.







4.







5.








Завдання 4. Розглянути способи розмноження мікроорганізмів та замалювати їх.



Рис. 2.4. Способи розмноження мікроорганізмів.

А. – ділення материнської клітини шляхом утворення перегородки, Б. – ділення шляхом перетяжки, В. – брунькуванням, Г. – баготоразове ділення, 1 – клітинна стінка, 2 – ЦПМ, 3 – мембранна структура, 4 – цитоплазма з центральним розміщенням нуклеотида, 5 – додатковий фібрилярний шар клітинної стінки.

Матеріали та обладнання: мікроскопи, предметні і накривні скельця; предметні стекла з луночками; спиртівка; сірники; бактеріологічні петлі; пінцети; промивалки з дистильованою водою; вазелін; розчин Люголя; спирт; фільтрувальні папірці; папірці просякнуті генціанвіолетом або фуксин; культура картопляної палички.

Завдання 4. Приготувати фіксований препарат бактерій, зафарбувати та Грамом. Мікроскопувати та замалювати.

Хід роботи

1. На предметне скло із шліфом нанести 2 краплі води і в них приготувати негустий мазок кожного виду бактерій.

2. Висушити препарат, зафіксувати над полум'ям спиртівки до відчуття легкого опіку тильної сторони долоні.

3. На препарат покласти пінцетом папірець, просочений генціанвіолетом, змочити його водою і щільно притиснути тримачем петлі. Зафарбовувати 2 хв. Папірець зняти пінцетом.

4. Нанести на препарат розчин Люголя на 2 хв. до почорніння мазка. Розчин злити до спеціального посуду.

5. Мазок обробити 30 секунд спиртом і промити водою.

6. Дофарбувати мазок розчином фуксину (1-2 хв), промити, висушити на повітрі і мікроскопувати з імерсією. Відзначити забарвлення:

Гр (+) бактерії зафарбовуються у фіолетовий колір при утворення стійкого до спирту комплексу генціанвіолету з йодом у клітинній стінці;

Гр (-) бактерії не утворюють такого стійкого комплексу. Їхні стінки знебарвлюються спритом і дофарбовуються фуксином, набуваючи рожевого кольору. Зробити висновок про зафарбування за Грамом різних видів бактерій.



Завдання 5. Приготувати тимчасовий препарат гнильних бактерій (Clostridium pasterianum) у "висячій краплі". Спостерігати процес спороутворення у бактерій. Ілюструвати та підписати.

Рис. 2.5. Процес спороутворення у бактерій



Проведення роботи.

1. На чисте покривне скельце прожареною препарувальною петлею нанести краплю різного середовища з гнильними бактеріями; знову прожареною голкою додати метиленову синьку або фуксин.

2. Краї лунки предметного скла змазати вазеліном за допомогою голки.

3. Покривним скельцем накрити предметне скло з лункою так, щоб лунка співпадала з краплею, але не роздавлювала її.

4. Притиснувши скельця злегка одне до одного, обережно перевернути препарат покривним скельцем угору. При цьому крапля повинна не розтікатися, а висіти над лункою. Це і є "висяча крапля". Такий препарат дає змогу спостерігати за об'єктом протягом тривалого часу.

Завдання 6. На фото зображені Clostridium pasterianum розглянути типи розміщення спор. Визначити тип спороношення та замалювати.

Рис. 2.6. Clostridium pasterianum


Завдання 7. Зробити висновок до проведеної практичної роботи.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 3

Тема: ВИГОТОВЛЕННЯ ШТУЧНИХ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ. МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ

Мета: вивчити принципи класифікацій бактерій, опанувати міжнародну класифікацію бактерій (за Бергі, 1984 р.); сформувати поняття про механізм надходження та типи живлення мікроорганізмів (автотрофія, хемотрофія, гетеротрофія, фотоорганотрофія); вивчити основні методи стерилізації поживних середовищ, посуду та мікробіологічних інструментів; опанувати методики приготування синтетичних і напівсинтетичних поживних середовищ; розвинути навички стерилізації, приготування штучних поживних середовищ та культивування на них мікроорганізмів; ідентифікувати їх та користуватися апаратом Кротова; виховувати культуру наукового дослідження. (2 години)
ПИТАННЯ ДЛЯ САМОПІДГОТОВКИ

  1. Поясніть, як підвищена та понижена температура середовища впливає на мікроорганізми.

  2. В чому проявляється вплив вологості середовища на мікроорганізми?

  3. Розкрийте суть впливу концентрації речовин, розчинених у середовищі та впливу випромінювань.

  4. В чому проявляється вплив біологічних чинників на життєдіяльність мікроорганізмів?

  5. Мінливість і спадковість мікроорганізмі.

  6. Чисті культури мікроорганізмів. Їх значення.

  7. Методи стерилізації у сухожаровій камері, автоклаві, апараті Коха.

  8. Методи стерилізації поживних середовищ, посуду, інструментів.

  9. Елективні поживні середовища, їх різноманітність і вимоги до них.

  10. Рецепти приготування поживних середовищ.



Теоретична частина

1. Поживні середовища.

2. Методи приготування поживних середовищ:

а) м'ясо-пептонний бульйон;

б) м'ясо-пептонний агар;

в) м'ясо-пептонний желатин;

г) бобовий агар;

д) сусло-агар;

є) сухий поживний агар.
1. Поживні середовища.

Для нагромадження, вирощування, виділення і зберігання мікроорганізмів у лабораторних умовах використовують різні поживні середовища. Виготовляють їх із продуктів рослинного та тваринного походження.

Для нормального росту і розвитку мікроорганізмів поживні середовища повинні містити всі необхідні елементи: макро- і мікроелементи, вітаміни, стимулятори росту тощо. Вони також повинні мати певні фізико-хімічні властивості: рН середовища, вологість, температуру, осмотичні властивості, окисно-відновний потенціал. Крім цього, обов'язковою умовою поживних середовищ повинна бути стерильність.

За складом поживні середовища поділяють на природні та штучні. Природні поживні середовища можуть містити такі натуральні продукти: молоко, відвар м'яса, овочі, картоплю, пивне сусло, хліб тощо. Штучні поживні середовища виготовляють або з хімічних речовин і натуральних продуктів (напівсинтетичні), або тільки з різних хімічних сполук (синтетичні).

За призначенням розрізняють прості, або звичайні, спеціальні та диференціально-діагностичні поживні середовища. До звичайних середовищ належать м'ясо-пептонний бульйон, м'ясо-пептонний агар, м'ясо-пептонний желатин та інші, на яких вирощують більшість сапрофітних і патогенних мікробів. На спеціальних середовищах (агар з кров'ю, агар із сироваткою, кров'яний телуритовий агар, жовткові середовища тощо) вирощують такі види мікроорганізмів, які не ростуть на простих поживних середовищах. До спеціальних належать також і елективні середовища, на яких створюються сприятливі умови для росту якого-небудь одного виду мікробів (бобовий агар, картопляний агар, сінна настоянка).

Диференціально-діагностичні поживні середовища (наприклад середовище Ендо для кишкової палички, середовище Штерна для сальмонел та інші) дають змогу швидко відрізнити одні види мікроорганізмів від інших.

За консистенцією середовища бувають рідкі, напіврідкі та тверді. Для вивчення фізіолого-біохімічних особливостей, а також для нагромадження мікробної біомаси (або продуктів її обміну) доцільно використовувати рідкі поживні середовища. Тверді середовища найчастіше застосовують для виділення чистих культур, підрахунку кількості бактерій та інших діагностичних цілей. Тверді поживні середовища виготовляють з рідких, додаючи до останніх 1,5-2,5 %-го агар-агару (виготовляється з морських водоростей) або 10-15 % желатину (суміш білкових речовин тваринного походження).

У мікробіологічній практиці широко застосовують також сухі поживні середовища, які випускаються у вигляді порошків (наприклад, сухий агар, сухий поживний агар, сухий агар Ендо, середовище Плоскірєва тощо). Якщо їх правильно зберігати, то вони довгий час не втрачатимуть своїх властивостей. Використання таких середовищ у навчальних лабораторіях є доцільним, бо заощаджує час при підготовці лабораторних занять.

2.Рецепти приготування поживних середовищ.

М'ясо-пептонний бульйон. Для виготовлення найуживаніших поживних середовищ – м'ясо-пептонного бульйону (МПБ), м'ясо-пептонного агару (МПА), м'ясо-пептонного желатину (МПЖ) та інших – насамперед треба приготувати м'ясну воду, оскільки вона є основою всіх цих середовищ. Із цією метою свіжу телятину або яловичину звільняють від жиру, сухожилків, фасцій і пропускають через м'ясорубку. До 0,5 кг фаршу додають у два рази більше води, розмішують, настоюють протягом 2 год при температурі 37-39°С. Одержаний настій проціджують через марлю і кип'ятять 20 хв до зсідання білків. Потім його фільтрують через вату або паперовий фільтр і стерилізують в автоклаві протягом 30 хв при температурі 120°С і тискові 1 атм.

До 1 л м'ясної води додають 5 г кухонної солі, 10 г пептону і кип'ятять до повного розчинення пептону. Додають насичений розчин бікарбонату натрію до слабколужної реакції і знову піддають кипятінню протягом 20 хв. Після чого доливають водою до початкового об'єму і фільтрують, розливають у колби і пробірки та стерилізують протягом 20 хв в автоклаві при температурі 120°С. Готовий бульйон повинен бути прозорим і мати янтарно-жовтий колір. Для скорочення часу середовище часто виготовляють із готових бульйонних кубиків.



М'ясо-пептонний агар виготовляють із м'ясо-пептоннго бульйону, додаючи 2-2,5 % подрібненого промитого агару. Помішуючи, його кип'ятять до повного розчинення агару. Потім гарячий розчин фільтрують через ватяно-марлевий фільтр і стерилізують протягом 5 хв при температурі 115°С у колбах, закритих ватними пробками.

М'ясо-пептонний желатин. До 1 л м'ясо-пептонного бульйону додають 100-150 г желатину і залишають для розбухання; підігрівають до повного розчинення желатину. Встановлюють лужну реакцію і кип'ятять протягом 5 хв. Далі розчин охолоджують до 40-50°С, додають змішаний із водою білок курячого яйця, знову підігрівають. При цьому білки випадають в осад і середовище стає прозорим. Його фільтрують гарячим і стерилізують.

Бобовий агар. 100 г білої квасолі або бобів заливають 1 л дистильваної водою і обережно кип'ятять, уникаючи розтріскування бобів і перетворювання крохмалю на клейстер. Гарячий відвар фільтрують і додають 2 % агару. Агар розплавлюють в автоклаві, осаджують колонії. Одержане середовище фільтрують і стерилізують так само, як і при виготовленні інших агарових середовищ.

Картопляне поживне середовище. З неушкоджених бульб картоплі вирізають плоскі шматочки, поверхню яких натирають крейдою для нейтралізації кислої реакції клітинного соку, і розкладають їх у чашки Петрі на зволожений фільтрувальний папір. У разі застосування пробірок краще вирізати з бульб циліндричні шматочки за допомогою коркового свердла. Чашки і пробірки з картопляним середовищем стерилізують в автоклаві протягом 10 хв при тискові 0,5 атм. На цьому середовищі добре вирощуються картопляна паличка та інші гетеротрофні мікроорганізми.

Сусло-агар. До пивного сусла додають 2 % очищеного агару. Середовище розварюють в автоклаві з відкритим вентилем і використовують для вирощування молочнокислих бактерій і дріжджів. Щоб приготувати поживне середовище із молока, збиране молоко розливають у пробірки приблизно по 10 мл, закривають ватними тампонами і стерилізують. У молочному середовищі містяться всі поживні речовини, необхідні для гетеротрофних мікроорганізмів.

Сухий поживний агар. У навчальних мікробіологічних лабораторіях найчастіше виготовляються поживні середовища сухого поживного агару або інших видів сухих поживних середовищ (залежно від мети занять), що випускаються мікробіологічною промисловістю. Для цього беруть 5 г порошку сухого поживного агар-агару на 100 мл холодної дистильованої води, старанно розмішують і розігрівають, помішуючи, до повного розчинення агару. Якщо розчин мутний, його фільтрують, а потім розливають у пробірки і стерилізують в автоклаві протягом 20 хв при 120°С.

Розливання поживних середовищ. Для проведення лабораторних занять у навчальних лабораторіях поживні середовища виготовляють, як правило, про запас і зберігають у великих колбах. Перед або на початку заняття середовища розливають у пробірки або чашки Петрі (залежно від мети занять). Тверді поживні середовища перед розливанням необхідно розплавити в автоклаві з відкритим вентилем або на водяній бані.

Після розплавлення середовище розливають у чашки Петрі або інший посуд (залежно від мети роботи), дотримуючись стерильності. Для цього на полум’ї спиртівки або газового пальника обпалюють горла колб, пробірок, корки тощо. Посуд із середовищем піддають стерилізації за одним із методів, які наводяться далі.


Практична частина

Матеріали та обладнання: апарат Кротова; автоклав; сушильна шафа; електроплитка; пептонний бульйон; промитий та подрібленнй агар-агар; куряче яйце; ватно-марлевий фільтр; круглодонна колба на 2 л, 6 чашок Петрі; 6 піпеток; 6 пробірок; газетний папір; 3 стерильні чашки Петрі; стерильне МПА; 9 стерильних піпеток; 2 колби на 100 мл; 5 стерильних пробірок; 2 штативи.

Завдання 1. Приготувати штучне поживне середовище м'ясо-пептонний агар (МПА). Записати методику до робочого зошита.

Проведення роботи.

Для виготовлення поживного середовища – м'ясо-пептонного агару (МПА), або м'ясо-пептонного желатину (МПЖ) насамперед треба приготувати м'ясну воду, оскільки вона є основою середовища.



1. М'ясна вода. Взяти свіжу телятину або яловичину, звільнити від жиру та сухожилків і пропустити через м'ясорубку. У фарш додати в два рази більше води, розмішати і настоювати протягом 2 годин при температурі 37-39°С. Одержаний настій процідити через кілька шарів марлі і прокип'ятити приблизно 20 хв. до зсідання білків. Далі профільтрувати його через паперовий фільтр і простерилізувати протягом 30 хв. при температурі 120º С. М'ясна вода може сама бути добрим поживним середовищем для багатьох видів мікробів.

2. Наступним етапом роботи є виготовлення м'ясо-пептонного бульйону. До 1 л м'ясної води додати 5 г NaCl, 10 г пептону і кип'ятити до повного його розчинення. У приготоване середовище додати насичений розчин вуглекислого натрію до слаболужної реакції, яку визначити лакмусовим папером, і знову кип’ятити протягом 20-30 хв Потім долити водою до початкового об'єму, встановити рН=7,8; профільтрувати (через полотняний фільтр), розлити в пробірки та стерилізувати в автоклаві 20 хв при температурі 120°С.



3. До м'ясо-пептонного бульйону додати 2-2,5 % подрібненого і промитого агар-агару або желатину; помішуючи, кип'ятити до повного розчинення його. Далі до 1 л агару додати збитий і розмішаний у подвійній кількості холодної води білок одного курячого яйця для видалення завислих у рідині речовин. Потім гарячий розчин профільтрувати через ватно-марлевий фільтр і стерилізувати протягом 45 хв. при температурі 5°С.У результаті ми отримаємо м'ясо-пептонний агар або м'ясо-пептонний желатин.

Завдання 2. Охарактеризувати та зафіксувати в лабораторному зошиті основні принципи стерилізації: на полум’ї, сухим жаром, кип’ятіння в автоклаві, пастеризація в апараті Коха. Провести стерилізацію чашки Петрі, піпетки, пробірки.

Проведення роботи

  1. Взяти чисті чашки Петрі, піпетки, пробірки, загорнути їх у папір.

  2. Покласти їх на 2 години у сушильну шафу в якій підтримувати температуру 160-170ºС.

  3. Стерильні предмети вийняти з сушильної шафи коли температура знизиться до кімнатної.

Завдання 3. Висівання бактерії води на агарову пластинку за методом Коха.

Проведення роботи

  1. Розплавлене і простерилізоване поживне середовище (МПА, МПЖ) розлити по стерильних чашках Петрі для одержання агарових пластинок. Після застигання агару чашки вміщують у термостат догори дном для підсушування на 1 годину.

  2. У кількох чашках Петрі з поживним середовищем обережно піднімають кришку і на центр агарової пластинки наносять краплину суспензії (води) досліджуваної культури.

  3. За допомогою стерильного скляного шпателя або мікробіологічної петлі обережно розтирають краплину по всій поверхні поживного середовища чашки та закривають її.

  4. Чашку Петрі ставляють у термостат для вирощування протягом 2-7 днів, залежно від швидкості росту культури.

Завдання 4. Дослідження мікрофлори повітря седиментаційним (від лат.-осідання) методом.

  1. Розплавлене і простерилізоване поживне середовище (МПА, МПЖ) розлити по стерильних чашках Петрі для одержання агарових пластинок. Після застигання агару чашки вмістити до термостата догори дном для підсушування на 1 годину.

  2. Відкриту чашку Петрі поставити на 5-10 хвилин у різних приміщеннях.

  3. По закінченні експозиції чашки Петрі закрити і зробити позначки олівцем по склу (де і коли проводився дослід).

  4. Поставити у термостат при температурі 28-30 С. На дві доби.

Завдання 5. Дослідження мікрофлори повітря методом Кротова.

  1. Розплавлене і простерилізоване поживне середовище (МПА, МПЖ) розлити по стерильних чашках Петрі для одержання агарових пластинок. Після застигання агару чашки вміщують у термостат догори дном для підсушування на 1 годину.

  2. Чашку Петрі з поживним середовищем закріпити на рухомому диску апарата Кротова.

  3. Ввімкнути Апарат Кротова на 3 хв. При цьому швидкість пропускання повітря повинна бути у межах 20-50 літрів на хвилину. Дослід повторити 3-4 рази.

  4. По закінченні експозиції чашки Петрі закрити і зробити позначки олівцем по склу (де і коли проводився дослід).

  5. Поставити до термостата при температурі 28-30 С на дві доби.

  6. Зробити висновки по проведеній практичної роботі.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 4
Тема: КІЛЬКІСНИЙ ОБЛІК БАКТЕРІЙ У ВОДІ, ПОВІТРІ І ГРУНТІ. РОЗКЛАДАННЯ КЛІТКОВИНИ. АНАЕРОБНИЙ ТА АЕРОБНИЙ РОЗКЛАД КЛІТКОВИНИ

Мета: встановити вплив фізичних і хімічних факторів на мікроорганізми; сформувати поняття – мікроорганізми як постійний компонент екосистеми. Вивчити мікрофлору води та повітря, а також хімізм аеробного і анаеробного розкладу клітковини, окислення спирту в оцет. Ознайомитись із збудниками цих процесів, навчитись їх розрізняти; дослідити зміни середовища під дією цих організмів Переконатись у можливості ефективного регулювання цих процесів, у конкретній участі мікроорганізмів у кругообігу вуглецевих сполук у біосфері; розвивати вміння вести облік бактерій у воді і повітрі методом підрахування на агарових пластинках, виховувати культуру наукового дослідження.
(6 годин: 2 години теоретичне заняття, 4 години практичне заняття)
ПИТАННЯ ДЛЯ САМОПІДГОТОВКИ

  1. Взаємовідносини між мікробами: симбіоз, метабіоз, коменсалізм, сателізм, антагонізм, паразитизм.

  2. Охарактеризуйте мікрофлору повітря.

  3. Розкрийте суть методик дослідження мікрофлори повітря.

  4. Мікрофлора води. Санітарні показники питної води.

  5. Методики, що дозволяють виявити мікроорганізми води.

  6. Способи очищення води (питної і стічної).

  7. Значення чистоти води. Заходи щодо охороні водного середовища. Значення біопланктону для розведення.

  8. Мікрофлора ґрунту основні методики дослідження ґрунтових мікроорганізмі.

  9. Як відбувається аеробний розклад клітковини в ґрунті.

  10. Як відбувається процес анаеробного розкладу клітковини в ґрунті.

  11. Значення розкладу клітковини в природі та народному господарстві.

  12. Перетворення спирту в оцет бактеріями. Технологія одержання оцту в мікробіологічній промисловості.


Теоретична частина

1. Вивчення мікроорганізмів повітря.

2. Мікрофлора води.

3. Мікрофлора ґрунту.

4. Розкладання клітковини.
1. Мікроорганізми повітря.

У перше мікроорганізми в повітрі були виявлені Пастером ще у другій половині ХІХ ст. Потрапляють вони туди із ґрунту разом із пилом, а також дрібними крапельками води, які здуваються із водної поверхні, та іншими шляхами. З пилинками мікроби з водної поверхні потрапляють навіть у нижні шари стратосфери. Чим більше забруднюватиметься повітря пилом, димом, кіптявою, тим більше в ньому мікроорганізмів. Найчастіше у повітря потрапляють спори Bacillus Clostridium, конідії грибів, шматки міцелію, цисти найпростіших і одноклітинних водоростей, пилок рослин, різні мікрококи і сарцини, аскоміцети, цвілеві та дріжджові гриби. Кількісний і якісний склад мікрофлори повітря в основному залежить від пори року, погоди, місця відбору проби.

Найбільша кількість мікроорганізмів у повітрі спостерігається над великими промисловими містами, менша – над сільською місцевістю і найменша – над морями, льодовими полями, горами і лісами. У лісах, особливо хвойних, мікробів дуже мало, бо на них згубно впливають леткі речовини – фітонциди. З віддаленням від населених пунктів кількість мікробів у повітрі помітно знижується.

Найбільше мікроорганізмів у повітрі закритих приміщень, особливо там, де скупчується багато людей. Ці дані наводять французькі вчені щодо кількості мікроорганізмів повітря у різних місцях Парижа. Наприклад, у районі Люксембурзького парку, який вважається найздоровішим місцем у Парижі, в 1м3 повітря виявлено 130 мікробів. У жилих приміщеннях кількість мікроорганізмів коливалась від 4000 до 8000 в 1 м3 повітря. В приміщенні вокзалу Сент-Луар – 50 000, а в магазинах – від 300 тисяч до 2 млн. Особливо багато мікробів у повітрі було виявлено у вихідний день в автомобільному салоні – 9 млн у 1 м3.

Для закритих приміщень санітарними показниками повітря є наявність у ньому стафілококів, зеленуватих стрептококів, а показником прямої епідеміологічної небезпеки – гемолітичних стрептококів і стафілококів. Орієнтовним критерієм чистоти повітря жилих приміщень вважають такий стан, коли в 1 м3 міститься не більше як 1500 бактерій і 16 стрептококів.

Своєчасне побілення, щоденне вологе прибирання приміщень, систематична вентиляція зменшують кількість мікробів у повітрі. В окремих випадках для очищення повітря застосовують дезінфекцію такими антисептиками, як технічна молочна кислота і триетилен-гліколь.

Найпростішим методом визначення мікрофлори повітря є седиментаційний метод, запропонований Р. Кохом. Суть його полягає у тому, що чашки Петрі з живильним середовищем залишають відкритими протягом 5-10 хв. на місці проведення досліду. За цей час на поверхню поживного середовища разом з пилом і краплинами вологи осідають мікроби, які інтенсивно розмножуються і через певний час утворюють колонії. Потім їх підраховують і аналізують. Цей метод осаджування дає тільки орієнтовні дані. Набагато точнішим є аспіраційний метод, розроблений Ю.А. Кротовим. За цим методом посів мікроорганізмів проводять за допомогою спеціального апарату. Досліджувати мікрофлору повітря можна також фільтраційним та іншими методами.
2. Мікрофлора води.

На відміну від повітря, природні водойми є середовищем, у якому мікроорганізми можуть розмножуватися, оскільки у воді завжди міститься та чи інша кількість органічних і мінеральних речовин, що можуть використовуватися для живлення мікробів. Кількісний і якісний склад мікрофлори різних природних джерел води різноманітний. Він залежить, насамперед, від забруднення води. Особливо багатий і різноманітний склад мікробів у стічних водах. Загальна кількість мікробів у 1 мл активного мулу стічних вод, за прямим підрахунком, становить 10-20 млрд. У середньому в 1 мл чистої води міститься від кількох десятків до кількох сотень мікроорганізмів. У воді прибережної зони водоймищ завжди набагато більше мікробів, ніж далі від берега.

Значні коливання кількості бактерій спостерігаються і за вертикаллю відкритих водоймищ (рік, озер, водосховищ, ставків). Найбільша кількість їх припадає на верхні шари води (5-20 см). Із глибиною кількість бактерій різко зменшується. Всі водні мікроорганізми поділяються на автохтонні (корінні жителі), адаптовані до екологічних умов даного водоймища, і алохтонні, які надходять у водоймище ззовні. Залежно від ступеня забрудненості, у водоймах можуть траплятися і певний час зберігати свою життєдіяльність патогенні мікроби; наприклад, у відкритих водоймах і у водогонах збудник дезинтерії може зберігатися від кількох днів до кількох місяців, а холерний вібріон – до 3 місяців.

Ступінь забруднення води мікробами прийнято виражати сапробністю – сукупністю організмів, що живуть у водах, які містять велику кількість тваринних або рослинних решток. За кількістю мікроорганізмів, що живуть у воді, водойми поділяються на кілька зон.



Олігосапробна зона. Кількість мікробів незначна. У 1 мл може бути від кількох десятків до кількох сотень мікробів. Кишкової палички тут немає. Зона характерна для чистої води. Колі-титр – від 1 і не більше 10.

Мезосапробна зона. Кількість бактерій у 1 мл – сотні тисяч, кількість кишкової палички незначна. Це зона помірного забруднення, в ній відбувається подальша мінералізація органічних речовин. Колі-титр – від 0,05 до 1.

Полісапробна зона. Вода у цій зоні дуже забруднена, бідна на кисень і багата на органічні сполуки. Кількість бактерій в 1 мл сягає 1 млн і більше, багато кишкової палички і анаеробних бактерій, які зумовлюють процеси гниття і бродіння. Колі-титр – від 0,005 до 0,001.

Виділяють ще так звану катаробну зону або зону дуже чистої води. Це водойми, розміщені далеко від населених пунктів. Дуже чистою вода в них буває в осінньо-зимовий час. Колі-титр цієї води становить 10-100.



3.Мікрофлора ґрунту.

Засновники наукового ґрунтознавства і ґрунтової мікробіології В.В. Докучаєв, П.А. Костичев, В.Р. Вільямс, С.М. Виноградський, В.Л. Омелянський у своїх працях показали, що мікроорганізмам належить винятково важлива роль у процесах ґрунтоутворення.

Процес руйнування мінералів і перетворення гірських порід на грунт відбувається при безпосередній участі живих організмів. Грунт є не лише місцем життя величезної кількості найрізноманітніших мікроорганізмів, а й продуктом їх життєдіяльності. С.М. Виноградський порівнює ґрунтове середовище з своєрідною мозаїкою, в якій рештки різноманітних речовин рослинного і тваринного походження оточені різними мікроорганізмами. Таким чином, розвиток мікрофлори в грунті відбувається не в гомогенному середовищі, а в окремих мікроділянках, які характеризуються (кожна зокрема) своїми умовами середовища.

У грунті мікроорганізми знаходять усі умови для розвитку: вологу, поживні речовини, захист від згубної дії прямих сонячних променів тощо. Лише завдяки цим сприятливим умовам кількість мікробів у грунтах величезна – від 200 млн. бактерій у 1 г глинистого грунту до 5 млрд. У 1 г чорнозему.

Грунт – основне джерело, звідки мікроби надходять у зовнішнє середовище – повітря й воду. Мікрофлора грунту дуже різноманітна. До її складу входять нітрифікуючі, азотофіксуючі, денітрифікуючі бактерії, сірко- і залізобактерії, целюлозорозкладачі, різні пігментні бактерії, актиноміцети, гриби, водорості, найпростіші тощо. Кількісний і якісний склад мікрофлори різних грунтів дуже змінюється залежно від хімічного складу грунту, його фізичних властивостей, реакції середовища, вмісту в ньому повітря і вологи.

На склад і кількість мікробів у грунті істотно впливають кліматичні умови, пори року, методи обробітку грунту, характер рослинного покриву та багато інших факторів. Неоднаково поширені мікроорганізми і по ґрунтових горизонтах. Найбільша кількість їх міститься у верхньому шарі грунту на глибині 5-20 см.

Досліди А.С. Разумова та інших показали, що на глибині понад 25 см кількість бактерій у 10-20 разів менша, ніж на глибині 2 см. У глибоких шарах грунту (2-5 м) трапляються лише поодинокі мікроби.

Наявність в 1 г грунту (верхнього шару) кількох мільярдів бактерій і актиноміцетів, до мільйона спор грибів і багатьох інших мікроорганізмів свідчить про велику біогенність грунту. В літературі наводяться дані, за якими в орному шарі окультуреного грунту на площі 1 га може міститися 5-6 т мікробної маси.

Серед різноманітної мікрофлори в грунті є і патогенні бактерії, проте грунт у цілому є несприятливим середовищем для життя більшості патогенних бактерій, вірусів, грибів, найпростіших. Тільки спори правцевої палички, збудника ботулізму, газової анаеробної інфекції можуть довгий час зберігатися у грунті.

Із різноманітної бактеріальної мікрофлори різних грунтів найглибше вивчено видовий склад спороносної групи бактерій (гнильні), серед яких найчастіше трапляються Bacillus subtilis. Колонії цих бактерій показують наскільки мікрофлора в грунтах різноманітна (автотрофи, гетеротрофи, багато видів грибів, мікроскопічних водоростей, найпростіших). Неможливо запропонувати якийсь універсальний метод її дослідження, необхідно користуватися різними методами. Одним із таких є розроблений ще в 1924 р. Виноградським бактеріоскопічний метод, який широко застосовується в мікробіологічній практиці. Суть його полягає в тому, що кількість бактерій визначають прямим підрахунком під мікроскопом, для чого попередньо виготовляють мікроскопічні препарати з певної маси грунтової суспензії, забарвлюють еритрозином і вивчають під мікроскопом. Виявлену за допомогою мікроскопа загальну кількість мікробів перераховують на 1 г грунту. Бактеріоскопічний метод відіграв велику роль у ґрунтовій мікробіології. Він змінив наші уявлення про кількість бактерій у грунті. Як показали дані, здобуті за допомогою цього методу, кількість мікробів у грунті повинна вимірюватись не тисячами на 1 г грунту, а сотнями мільйонів, мільярдами.

Клітковина належить до складних цукрів – полісахаридів. Вона складається з великої кількості (100-200) молекул глюкози, з'єднаних у вигляді довгого ланцюжка. У свою чергу, ланцюжки зв'язані у так звані фібрили. Клітковина у великій кількості входить до складу тіла рослини. Після відмирання рослини вона потрапляє в грунт і розкладається мікроорганізмами. Здатність мікробів розкладати клітковину в грунті вперше встановив Л. Попов у 1875 р. Клітковину можуть розкладати спеціальні мікроорганізми, які мають фермент целюлози. До цієї групи мікроорганізмів належить кілька різновидів аеробних і анаеробних форм. У грунті велику роль відіграють аеробні мікроби, що розкладають клітковину. Серед них є різні бактерії, гриби і зрідка актиноміцети. Особливо активно розкладає клітковину бактерія Myxococcus hutchinioiii із складним циклом розвитку, що належить до групи міксобактерій. Із інших груп аеробних бактерій активну участь у розкладі клітковини бере Cellvibrio – паличкоподібна зігнутої форми бактерія з полярно розміщеним джгутиком. Деякі види Cellvibrio можуть утворювати зелений або жовтий пігмент. Myxococcus і Cellvibrio докладно вивчив С.М. Виноградський.

4. Розкладання клітковини.

Основним складником оболонок рослинних клітин є клітковина. Вона є найпоширенішим полісахаридом рослинного світу. В ній міститься понад 50 % усього вуглецю біосфери.

Розклад клітковини в природі відбувається за допомогою бактерій, актиноміцетів, грибів за анаеробних і аеробних умов. По суті, бродіння клітковини є особливим видом маслянокислого бродіння. Процес починається з ферментативного гідролізу клітковини під впливом ферменту целюлози, в результаті чого утворюється дисахарид – целобіоза. Остання під впливом ферменту целобіази перетворюється на глюкозу. Глюкоза в анаеробних умовах зброджується за типом маслянокислого бродіння. Склад кінцевих продуктів значною мірою залежить від мікроорганізмів і умов, у яких вони розкладають клітковину.

На поверхні грунту, і особливо в його верхніх шарах величезна маса клітковини розкладається аеробним способом. Серед мікробів, які найбільш енергійно розкладають клітковину: Achromobacter Cytophara Vibrio.

Загальна схема цього процесу така: під впливом ферменту целюлози, що виділяється мікроорганізмами, гідролізується клітковина целобіози. Остання в свою чергу під дією ферменту целобіози розщеплюється з утворенням глюкози:

6Н10О5)n+½n(Н2О) ½n (C12Н22О11),

½ (С12О22Н11)n+1/2 n (Н2О)n (С6Н12О6)

Далі глюкоза за допомогою кисню окислюється до вуглекислого газу і води. При цьому може нагромаджуватися також невелика кількість органічних кислот.



Практична частина

Матеріали та обладнання: мікроскопи; предметні і накривні скельця; спиртівка; сірники; бактеріологічні петлі; пінцети; препарувальні голки; чашки Петрі з колоніями бактерій; висіяних з грунту; акваріумної воли та повітря; промивалки з дистильованою водою; паперові сегменти; розчин Люголя; спирт; фільтрувальні папірці; папірці просякнуті генціанвюлстом; метиленова синька або фуксин.

Завдання 1. Охарактеризувати особливості колоній мікроорганізмів та замалювати в альбом: форму, профіль, край, структуру колонії. Підписати.



Форма



Профіль


Край


Структура колоній

Рис. 4.1. Особливості колоній і мікроорганізмів


Завдання 2. Провести кількісне визначення мікроорганізмів у повітрі та описати культуральні ознаки найхарактерніших колоній.

  1. Визначити площу поживного середовища з колоніями у чашці Петрі за формулою S=πr2.

  2. Зробити перерахунок кількості колоній, які утворилися на площі 100 см2.

  3. Описати культуральні ознаки колоній. Результати зафіксувати у таблиці.




Колонія

Форма

Край

Стрктура

Поверхня

Профіль

Колір

Розмір

Конснс тенція































  1. Провести мікроскопічне дослідження. Для цього з найхарактерніших колоній виготовити мікропрепарати.

  2. Визначати основні морфологічні особливості бактерій та описати їх.

  3. На основі культуральних та морфологічних ознак встановити рід.

Завдання 3. Провести кількісне визначення мікроорганізмів у воді та встановити культуральні ознаки найхарактерніших колоній.

  1. Визначити площу поживного середовища з колоніями у чашці Петрі за формулою S=πr2.

  2. Зробити перерахунок кількості колоній, які утворилися на площі 100 см2. Якщо посів проводився без попереднього розведення, то кількість колоній, які одержані в чашці, дорівнюватиме вмісту бактерій в 1 мл. води. В разі розведення треба помножити кількість колоній на відповідне розведення.

  3. Описати культуральні ознаки колоній. Результати зафіксувати в таблиці.




Колонія

Форма

Край

Структура

Поверхня

Профіль

Колір

Розмір

Конснстенція































  1. Користуючись даними таблиці та враховуючи одержані результати, визначити ступінь забруднення води .




Ступінь забруднення води

Кількість бактерій в 1 мл.

дуже чиста

а*10

чиста

а*102

помірно забруднена

а*103

забруднена

а*104

брудна

а*105

дуже брудна

а*106
1   2   3   4   5   6


База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка