Реферат 2014 Актуальність дослідження




Скачати 164.19 Kb.
Дата конвертації17.04.2016
Розмір164.19 Kb.
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України

Наукова робота

на здобуття щорічної премії Президента України для
молодих вчених

Застосування низьких температур для створення девіталізованих судинних скафолдів




БИЗОВ Денис Володимирович 

к.мед.н., науковий співробітник Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України.













РЕФЕРАТ

2014

Актуальність дослідження

Захворювання серцево-судинної системи і, перш за все, атеросклероз та його ускладнення займають перше місце серед причин летальності та інвалідизації дорослого населення економічно розвинених країн світу. Загальновизнаним «золотим стандартом» лікування серцево-судинних захворювань, зумовлених облітерацією артерій, що використовується при неефективності медикаментозної терапії та ендоваскулярної ангіопластики / стентування, є операції судинного протезування або шунтування, які являють собою заміну / обхід облітерованого сегменту артерії за допомогою судинних протезів і реваскуляризацію зони ішемії. Судинні графти широко використовуються при гострій травмі та в комплексі допоміжних хірургічних методів лікування неваскулярної патології: формування гемодіалізних артеріо-венозних шунтів, судинні вставки при радикальних операціях та органних трансплантаціях.

Результати реконструктивних операцій з використанням судинних протезів багато в чому визначаються їх видом та якістю. На теперішній час існує декілька видів судинних графтів. Найкращими замінниками артерій малого діаметру (≤ 6мм) як і раніше вважаються аутологічні артерії та вени, проте їх використання значною мірою обмежено з різних причин, у тому числі у зв’язку з травматичністю їх виділення. В 30% випадків придатні для трансплантації вени у пацієнта відсутні або залучені у патологічний процес. Синтетичні, ало- і ксеногенні графти малого діаметру схильні до гострих тромбозів, відторгнення, хронічного запалення, кальцинозу та гіперпластичної оклюзії. Основними якостями ідеального судинного трансплантату повинні бути довгострокова прохідність, біологічна сумісність, механічна міцність, гіпоалергенність та гіпоімуногенність, відсутність токсичності, низька вартість, можливість серійного виробництва та відсутність тромбогенності. Максимально наближеними до цих якостей є так звані девіталізовані протези, або скафолди, – сучасний напрямок в експериментальній судинній хірургії і трансплантології, що являють собою ділянку ксеносудини, штучним шляхом позбавленої ендотеліального та м'язового шарів. Природні біологічні тканини у значній мірі перевершують синтетичні матеріали у якості судинних протезів малого діаметру, проявляють кращі адгезивні властивості при подальшій ендотелізації та сприяють росту ендотелію.

Сучасні методи девіталізації пов'язані з багаторазовою обробкою ксеносудин розчинами детергентів, ензимів, різноманітних гіпо- та гіпертонічних буферів, яка повинна забезпечувати повну девіталізацію судини і досягнення максимальної гіпоімуногенності. Слід зазначити, що використання для девіталізації цитотоксичних речовин та ензимів значно ускладнює подальшу інтеграцію протезу в організм реципієнта, що обумовлено збереженням залишкової цитотоксичності після протезування, і сприяє зменшенню характеристик міцності ксенопротезів за рахунок пошкодження сполучнотканинних волокон судинної стінки. Крім того, висока вартість одержуваних графтів також обмежує можливості судинних хірургів повною мірою використовувати девіталізовані судинні ксенографти.

Необхідність використання судинних ксенопротезів як в практичній медицині, так і в наукових дослідженнях не викликає сумнівів. Пошук і реалізація більш ефективних, економічно обґрунтованих методик отримання судинних скафолдів мають величезне значення для створення повноцінних ксенобіопротезів.

Мета роботи полягала в експериментальній оцінці ефективності використання низьких температур у комбінації з іонізуючим опроміненням для девіталізації ксеногенних артерій малого діаметру, розробці методики отримання гіпоімуногенних біологічних судинних ксеноскафолдів.

Матеріали і методи дослідження. Всі експерименти проведені відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах», схвалених III Національним конгресом з біоетики (Київ, 2007) і узгоджених з положеннями «Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985).

Об'єктом дослідження були внутрішні грудні артерії свині (a.thoracica interna), виділені у безпородних свиней віком 8-10 міс протягом 20хв після забою. Артерії ретельно препарували, видаляли жирові привіски і надлишки сполучної тканини з боку адвентиціальної оболонки. Внутрішній діаметр виділених артерій варіював від 2,5 до 3,5 мм, довжина – від 5 до 20см. Судини промивали охолодженим стерильним фізіологічним розчином з додаванням антибіотиків і протигрибкових препаратів, після чого поміщали в стерильні полімерні кріоконтейнери, не допускаючи деформування судинної стінки в поздовжньому і поперечному напрямках. У подальшому пробірки занурювали в рідкий азот, де і зберігали до моменту використання.

Відігрів пробірок виконували на водяній бані при +36°С. Відігріті зразки транспортували в ННЦ ХФТІ НАН України, де за допомогою лінійного прискорювача електронів ЛУЕ-10 проводили їх опромінення потоком електронів у двох експериментальних режимах: 25 кГр і 50 кГр. При цьому енергія опромінення становила до 10 МеВ, а середній струм – 1 мА. Дозу 25 кГр вибрано як мінімально необхідну для забезпечення стерильності медичних матеріалів (ISO/TS13409: 2002). Верхню дозу опромінення було вибрано як максимально допустиму для збереження сполучнотканинних волокон. У процесі опромінення температуру зразків постійно контролювали (не більше 25°С) з метою попередження теплової денатурації сполучнотканинних структур. Час від моменту відігріву контейнерів до моменту початку опромінення знаходився у межах 90-120хв. Для вивчення ізольованої дії іонізуючого опромінення на артерії свині у вищевказаних режимах також опромінювали нативні судини. Зберігання зразків після опромінення здійснювали в парах рідкого азоту при температурі від -150 до -170°С.

Після експериментальних впливів морфологічну структуру артерій досліджували на гістологічних зрізах при забарвленні гематоксиліном та еозином, по Ван-Гізону в модифікації Вергоффа та за допомогою імпрегнації сріблом міжендотеліальних границь за Zand T.

Морфометричні дослідження судинної стінки проводили за стандартизованими методиками на гістологічних зрізах за допомогою програмного забезпечення BioVision 4.0 і AxioVision 4.8.Вимірювали товщину судинної стінки тавнутрішній периметр артерії, внутрішній та зовнішній радіуси судинного просвіту.

Ультраструктуру артеріальної стінки досліджували за допомогою електронного мікроскопу ПЕМ-125К при напрузі прискорення 75kV, обладнаного системою зйому та аналізу зображення з використанням CCD камери DX-2 і пакету програм фірми "KAPPA" (Німеччина).

Біомеханічні властивості артерій досліджували на базі кафедри опору матеріалів Національного технічного університету«Харківського політехнічного інституту» (НТУ ХПІ). Вимірювання міцності в поздовжньому напрямку (strength-test), пружності і показника максимального розтягнення артерій проводили на універсальному деформуючому пристрої FP100/1(VEB TIW Rauenstein, Німеччина).

З метою зменшення можливих похибок вимірювань, викликаних неоднорідністю судинної стінки на різних ділянках однієї артерії, на підставі абсолютних показників навантаження, прикладеного в певнуодиницю часу, був обчислений відповідний показник напруження артеріальної стінки. Для визначення останнього, поперечний зріз кожного артеріального сегменту, взятий безпосередньо перед проведенням випробування, вимірювали з точністю до 10мкм на мікроскопі Meiji Techno (Японія) в 10 точках за периметром і розраховували середнє значення. Також вираховували значення відносної деформації судинної стінки, відповідне кожному показнику напруження.

Вивчення міцності артерій в радіальному напрямку (burst-test) проводили на пристрої, що складається з ресивера з електронним датчиком тиску MPX-5700DP (Freescale Semiconductor, Китай).

Статистичні дані оцінювали за універсальним критерієм достовірності Манна-Уітні. Відмінності вважали достовірними при p<0,05.

Для вивчення біосумісності і ступеню імуногенності артерій на етапах девіталізації виконували їх ксеноімплантацію. Дослідження проводили на 80 самках щурів лінії Wistar. Імплантацію сегментів артерій виконували під шкіру. На термінах 3, 7, 14 діб, 4 та 8 тижнів після операції тварин виводили з експерименту, імплантовану ділянку артерії вилучали. Оцінювали макроскопічну реакцію тканин на імплантат, а також ступінь клітинної інфільтрації вилучених артеріальних лоскутів і оточуючих їх тканин на гістологічних препаратах за допомогою оптичної мікроскопії.

Вивчення функціональності, гемосумісності і ступеню тромбогенності проводили на безпородних кролях. Було виконано 10 операцій ксенопротезування інфраренального сегменту черевної аорти з використанням у якості судинних графтів девіталізованих ксеноартерій. Антикоагулянтні та антиагрегантні препарати у післяопераційному періоді не застосовували.



Отримані результати та їх обговорення

Вплив низьких температур та опромінення потоком електронів на морфологічну структуру артерій. Було виявлено, що заморожування до температури рідкого азоту призводить до формування широких деендотелізованих полів, що виражалося в деструкції і розпаді цементних ліній, які характеризують стан міжклітинних контактів. Збережені групи ендотеліоцитів характеризувалися гетерогенністю за площею та поліморфізмом клітин, виявлялися мікродефекти міжендотеліальних контактів. У збережених ендотеліоцитах спостерігалося набухання ядер, деструкція органел і розриви цитолемми. Проте базальна мембрана, що розташовується під ендотелієм, практично не ушкоджувалася. Внутрішня еластична мембрана зберігала структурну цілісність і не зазнавала деформацій. Для гладеньком'язових клітин (ГМК) були характерні зміни форми і ультраструктури ядер, які виявлялися у вигляді відсутності інвагінацій каріолемми і розрихлення гетерохроматину, що свідчить про набухання ядер. Еластичні волокна характеризувалися зниженням звитості і компактним розташуванням, що пов'язано з формуванням зшивок між сполучнотканинними волокнами, їх зближенням за рахунок заповнення простору деформованих м'язових волокон, а також частковою дегідратацією судинної стінки. Компактне розташування сполучнотканинних волокон після заморожування-відігріву також обумовлене їх «зв'язуванням» між собою під дією тиску кристалів льоду, що утворюються в позаклітинному матриксі. Цілісність сполучнотканинних волокон, їх безперервність, впорядкованість і просторове орієнтування не порушувалися.

Комбінування заморожування-відігріву і подальшого іонізуючого опромінення дозволило домогтися не тільки довгострокового зберігання артерій, а й максимальної ушкоджуючої дії на клітинні елементи судинної стінки. Аналіз стану артеріальної стінки після впливу низьких температур та опромінення не показав суттєвої різниці в їх ультраструктурному стані в залежності від поглиненої дози. Інтима девіталізованих артерій була представлена добре збереженою внутрішньою еластичною мембраною, контури якої чітко диференціювалися, порушення безперервності не спостерігалися. Ендотеліальний шар був відсутній по всій довжині артерії. Середня оболонка складалася з рихлих і деформованих м'язових волокон, на протязі яких визначалися великі електронно-світлі порожнини з фрагментами зруйнованих гладеньком’язових клітин. Структурна цілісність і безперервність сполучнотканинних волокон після обох доз опромінення переважно зберігалися. При цьому клітинні елементи судинної стінки після комбінованої дії двох фізичних факторів зазнавали деструкції.

Морфометричні вимірювання продемонстрували, що товщина судинної стінки змінювалась у всіх групах оброблених артерій, проте не завжди супроводжувалася відповідними змінами люмінального периметру, внутрішнього і зовнішнього радіусу. Це пов'язано з різною чутливістю сполучнотканинних волокон і ГМК судинної стінки до досліджуваних фізичних факторів. Було підтверджено, що заморожування-відігрів, на відміну від опромінення в дозі 50 кГр, не впливає на внутрішню еластичну мембрану. При комбінованому впливі двох досліджуваних фізичних факторів спостерігалися зміни, характерні для кожного з них окремо.При цьому вираженість ефекту опромінення була меншою після попереднього заморожування-відігріву у порівнянні з ізольованим опроміненням.

Біомеханічні властивості ксеногенних артерій на етапах девіталізації. Адекватні біомеханічні характеристики артеріальних протезів є важливим компонентом їх функціональності, корелюючим з міцністю швів судинних анастомозів і резистентністю артерій до дилатації in vivo. Усереднені по всіх вимірюваним зразками криві залежності напруження-деформація нативних артерій і артерій після девіталізації наведені на рис.1.

Всі криві мали характерну для сполучнотканинних структур S-подібну форму, з чітко диференційованими ділянками, що відповідають в’язкій течії, пружній деформації і напруженню руйнування тканини.



Р4-конечная звезда 32ис. 1. Залежність відносної деформації судинної стінки від прикладеного навантаження. – достовірно (p < 0,05) відносно контролю.

Початкові відрізки кривих, що характеризують, в основному, ковзання окремих фібрил у волокні відносно одна одної, відповідають області фізіологічних навантажень на артерії і для всіх досліджуваних груп знаходяться у межах границь варіабельності показників нативних судин. Довжина областей пружної деформації всіх груп оброблених артерій в значній мірі перевищує даний показник в нативних артеріях, тобто прикладене навантаження, яке викликає початкове руйнування окремих сполучнотканинних фібрил в групі нативних артерій, призводить лише до додаткового їх подовження після впливу досліджуваних фізичних факторів.

Було виявлено, що заморожування-відігрів, так само як і комбінація заморожування-відігріву та іонізуючого опромінення, підвищує міцність артерій у поздовжньому напряму у 2 рази.

Проте міцність артерій у радіальному напряму підвищувалася тільки після опромінення (рис.2).

Рис. 2. Механічна міцність артерій в радіальному напрямку, кПа.



4-конечная звезда 34 – достовірно (р < 0,05) відносно контролю.
Біосумісність і ступінь імуногенності артерій після заморожування-відігріву та іонізуючого опромінення. Результати ксеноімплантації продемонстрували розвиток вираженого гострого імуногенного запалення, яке переходило в хронічний процес в групі нативних артерій, що призводило до деструкції сполучнотканинних волокон судинної стінки, формування осередків кальцинозу і ранньої біодеградації імплантату (рис.3а). Реакція на заморожені-відігріті артерії була менш вираженою і проявлялася лише у помірній лейкоцитарній інфільтрації на ранніх термінах спостереження, ущільненні і склерозуванні волокон, розростанні сполучної тканини навколо імплантату до 8-го тижня спостереження (рис.3б). Гострі клітинні реакції в групах артерій після заморожування та опромінення в обох дозах не відзначалися. На 2-му тижні спостереження виявлялися поодинокі макрофагальні «острівці» в судинній стінці. До 8 тижня було виявлено рівномірне заселення судинної медії макрофагами і клітинами фібробластичного ряду, які є невід'ємним компонентом процесу ремоделювання біоімплантату. При цьому спостерігалося збереження структурної цілісності сполучнотканинних волокон (рис.3в, г).


группа 15

Рис. 3. Імплантація під шкіру, 8 тижнів після операції.

А – нативні артерії; стрілкою позначена ділянка кальцинозу;

Б – артерії після заморожування-відігріву;

В – артерії після заморожування і опромінення 25 кГр;

Г – артерії після заморожування і опромінення 50 кГр.

Забарвлення гематоксиліном та еозином, х200


группа 8

Рис. 4. Девіталізований графт, 7 діб після операції.

А – макроскопічна картина, стрілкою позначений протез;

Б – стінка протезу, забарвлення гематоксиліном та еозином, х200; стрілкою позначена люмінальна поверхня.


группа 1Рис. 5. Девіталізований графт, 12 міс після протезування.

А – макроскопічна картина, стрілкою позначений протез;

Б – стінка протезу, забарвлення гематоксиліном та еозином, х200; стрілкою позначена люмінальна поверхня.



Результати ксенопротезування сегменту черевної аорти. Було виконано 15 експериментальних операцій судинного протезування. Відмова від використання антикоагулянтних препаратів дозволила оцінити гемосумісність внутрішньої поверхні протезу в несприятливих умовах напруженої згортально-протизгортальної системи крові, активованої операційною травмою, крововтратою і розкриттям судинного просвіту. Всі трансплантовані біологічні графти зберігали функціональність в повному обсязі. Гострі тромбози і стенотичні зміни, викликані властивостями протезу, на ранніх і віддалених термінах спостереження були відсутні.

Гістологічне дослідження девіталізованих протезів продемонструвало відсутність реакцій відторгнення та імуногенного запалення на всіх строках спостереження. Вже на 1-у добу післяопераційного періоду було виявлено значний ступінь лізису залишившихся фрагментів ГМК. До 7-ї доби спостереження макроскопічно протез зберігав початковий вигляд, візуально люмінальна поверхня не відрізнялася від аорти (рис.4а). Сполучнотканинна структура протезу не ушкоджувалася і була представлена впорядковано розташованими, безперервними волокнами без ознак біодеградації і деструктивно-некротичних змін. Клітинні фрагменти не візуалізувалися (ріс.4б). В параанастомозній зоні визначалися окремі групи ендотеліоцитів. До 15-ї доби післяопераційного періоду було виявлено формування численних вогнищ ендотелізації по всій довжині люмінальної поверхні протезу, заселення судинної медії поодинокими макрофагами і початок формування vasa vasorum в адвентиціальному шарі. У терміни 6-9 міс після операції деструктивно-дегенеративні зміни з боку біопротезу були відсутні. В цей період в судинній медії виявлялися поодинокі макрофаги, фібробласти і ГМК при збереженні повноцінної сполучнотканинної структури стінки протезу. Максимальне заселення стінки протезу клітинами реципієнта було виявлено в період 9-12 міс після трансплантації. Так, до 12 міс спостереження відзначалося значне збільшення кількості клітин, переважно фібробластів, в судинній медії при збереженні цілісності і впорядкованості сполучнотканинної структури девіталізованих судин. Деструктивно-некротичні зміни були відсутні по всій довжині графту. Люмінальна поверхня протезу візуально не відрізнялася від аорти, пристінкові тромби і стенотичні зміни були відсутні (рис.5). Інтима була представлена чисельними вогнищами ендотелізації при відсутності безперервної вистілки, що пов'язано з незавершеним до даного терміну ремоделюванням і триваючим процесом оновлення сполучнотканинної структури протезу, у т.ч. параінтимальної зони. Оскільки стійка ендотелізація неможлива без повноцінної регенерації інших судинних структур, що пов'язано з потребою в структурних, метаболічних і функціональних зв'язках з медіальний шаром, і структурно-функціональної єдності регенеруючих судинних структур, наявність чисельних вогнищ ендотелізації в умовах незавершеного ремоделювання біологічного графту представляється сприятливим результатом.

Таким чином, максимальний термін спостереження після трансплантації склав 34 міс, що, враховуючи середню тривалість життя експериментальних тварин, є цілком достатнім для підтвердження довготривалої спроможності протезу. Протягом всього післяопераційного періоду девіталізовані ксенографти адекватно функціонували, забезпечуючи достатнє кровопостачання. Ознаки відторгнення, імуногенних запалень, стенозів і аневризматичних дилатацій були відсутні.

За результатами проведених досліджень виявлено позитивні характеристики ксеногенних артерій, девіталізованих низькими температурами та іонізуючим опроміненням, які обґрунтовують доцільність подальших досліджень і можливість їх впровадження в клінічну практику.


Узагальнення та висновки.

Таким чином, наукова робота містить теоретичне та експериментальне обґрунтування нового підходу – комбінованої дії низьких температур та іонізуючого опромінення – для девіталізації ксеноартерій малого діаметру з метою створення гіпоімуногенних біологічних судинних протезів. Переваги використання зазначених фізичних факторів полягають у чіткому дозуванні, можливості стандартизації, стерилізації, тривалого зберігання біоматеріалу та відсутності пролонгації цитотоксичної дії.

На основі проведених досліджень розроблена технологія девіталізації ксеногенних артерій малого діаметра зазначеними фізичними факторами, яка включає ряд етапів:

1. Заготівля і заморожування артерій малого діаметру від статевозрілих свиней. На даному етапі експериментально відпрацьована методика виділення, скелетування, промивання судин і підготовки їх до заморожування, яке проводили без використання кріопротекторів з метою максимального пошкодження клітинних компонентів при збереженні цілісності сполучнотканинного каркаса. За допомогою оптичної та електронної мікроскопії було вивчено вплив низьких температур на морфологічну структуру артерій. Досліджено біомеханічні параметри судинної стінки після заморожування-відігріву. Показано, що кріопошкодження переважно зазнають ендотеліальні клітини і м'язові волокна, при цьому сполучнотканинні волокна судинної стінки практично не пошкоджуються. Слід також зазначити можливість довгострокового зберігання ксеноартерій на даному етапі.

2. Остаточна девіталізація і стерилізація артерій. На даному етапі теоретично обгрунтовані і експериментально розроблені режими опромінення артерій, що дозволяють добитися бажаного результату. Вивчено вплив опромінення потоком електронів на морфологічну структуру і біомеханічні властивості артерій, у тому числі після попереднього заморожування-відігріву. Показано, що опромінення потоком електронів в дозах 25 і 50 кГр викликає повну девіталізацію артерії: десквамацію ендотелію і деструкцію гладеньком’язових клітин, при цьому значущі пошкодження сполучнотканинних волокон не відзначаються.

3. Оцінка ефективності девіталізації in vivo. На даному етапі експериментально вивчена біосумісність і ступінь імуногенності судин після девіталізації у порівнянні з нативними артеріями при експериментальної ксеноімплантаціі. Досліджено гемосумісність, тромбогенність та функціональність девіталізованих артерій в системному кровотоці при ксенопротезуванні сегменту аорти. При виконанні оперативних втручань було розроблено експериментальну хірургічну модель для вивчення судин малого діаметру в системному кровотоці. Особливістю моделі є можливість тривалих маніпуляцій на аорті кролика без розвитку клінічно значущих ішемічних ушкоджень спинного мозку. Тривалі терміни посттрансплантаційного спостереження (34 міс) продемонстрували адекватне функціонування судинних біопротезів, відсутність тромбозів, ранньої біодеградації, фіброзно-рубцевого переродження графтів, стенозів, оклюзій і реакцій відторгнення ксенотканини навіть в умовах високих фізіологічних навантажень і відсутності антикоагулянтної медикаментозної підтримки. Девіталізований графт в організмі реципієнта зазнає поступового ремоделювання та ендотелізації.

Розроблений метод девіталізації ксеногенних артерій не має світових аналогів та теоретично може бути використаний для зниження імуногенності будь-яких сполучнотканинних ксеногенних біооб’єктів, зокрема серцевих клапанів, перикарду, хрящів та сухожиль. Комбінація заморожування-відігріву та іонізуючого опромінення для девіталізації артерій у значній мірі перевершує хімічні методи девіталізації, більшість з яких призводять до тромбування оброблених судин у різні терміни спостереження. Тривалі строки функціонування девіталізованих розробленим методом артерій при експериментальному ксенопротезуванні є дуже позитивним результатом, що обґрунтовує доцільність повноцінних доклінічних і клінічних досліджень та перспективність створення низькотемпературного банку судинних ксенобіопротезів. Враховуючи високу вартість медичної біотехнологічної продукції, створення банку серцево-судинних біопротезів є надзвичайно перспективним з економічної точки зору. Потенційні ринки збиту продукції – країни СНД, східна та західна Європа.

Наукові результати роботи опубліковано у 8 статтях в спеціалізованих наукових журналах, у тому числі 1 – в зарубіжному виданні, 1 – розділ монографії; та 14 тезах доповідей на міжнародних наукових конференціях та з’їздах, оформлено 1 Патент України на корисну модель.



Претендент: к.мед.н., н.с. Бизов Д.В.


База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка