Системный подход к оценке состояния иммунного гомеостаза при остром инфаркте миокарда 14. 00. 36 аллергология и иммунология




Сторінка2/4
Дата конвертації21.04.2016
Розмір0.67 Mb.
1   2   3   4

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка чувствительности лимфоцитов крови к нейромедиаторам вегетативной нервной системы норадреналину и ацетилхолину in vitro

На первом этапе исследования нами были разработаны методологические подходы (условия инкубации, концентрации, показатели морфо-функционального состояния клеток) к оценке чувствительности лимфоцитов к норадреналину и ацетилхолину по показателям выраженности апоптоза и экспрессии на их поверхности CD3-антигена. Апоптотическое действие нейромедиаторов на лимфоциты крови оценивали в сравнении с классическим индуктором апоптоза – преднизолоном.

В ходе проведения нескольких серий предварительных экспериментов in vitro нами было установлено, что наиболее оптимальными для оценки влияния исследуемых нейромедиаторов и преднизолона на лимфоциты крови являются следующие концентрации норадреналина и ацетилхолина: 1∙10-5 моль/л (кровь человека), 1∙10-6 моль/л (кровь собак), преднизолона – 0,25∙10-3 моль/л; время инкубации для оценки морфометрических и морфоструктурных характеристик клеток - 2 часа, для проведения ДНК-цитометрии и оценки экспрессии CD95- и CD3-антигенов – 24 часа. Эти условия инкубации были нами использованы в дальнейших исследованиях.

Анализ полученных данных выявил, что инкубация крови с норадреналином в течение 2-х часов не приводит к изменению морфометрических и морфоструктурных характеристик лимфоцитов, а преднизолон и ацетилхолин (рис. 1) вызывают снижение (p<0,05) значений


Рис. 1. Изменение морфоструктурных характеристик лимфоцитов крови человека и экспериментальных животных после 2-х часов инкубации с ацетилхолином и преднизолоном

показателей площади клеток и ядер, параметра FSC; повышение (p<0,01) ЯЦО, что может свидетельствовать об апоптотических изменениях в клетках. Статистически значимых изменений SSC параметра, отражающего оптическую гранулярность лимфоцитов, под действием нейромедиаторов и преднизолона выявлено не было из-за высокой вариабельности значений показателя.

Известно, что на лейкоцитах, способных принимать сигналы к апоптотической гибели, появляется CD95 (Fas)-антиген. Вместе с тем, этот антиген рассматривается как активационный, появляющийся, прежде всего, на активированных клетках, гиперпродукция которых может в дальнейшем ограничиваться их гибелью по пути апоптоза.

Для оценки изменений экспрессии данного антигена на поверхности лимфоцитов крови, как признака апоптотической гибели, нами была проведена сравнительная оценка изменений содержания CD3+95+, CD3-95+, CD95+ лимфоцитов и параметров FSC данных клеток, а также количества гиподиплоидных лимфоцитов после 24-х часов инкубации с нейромедиаторами и преднизолоном (рис. 2).

1- CD3+(%); 2- CD3+95+(%); 3- CD3-95+(%); 4- CD95+(%); 5- CD3+95+(FSC);

6- CD3-95+(FSC); 7- CD95+(FSC); 8- гиподиплоидные лимфоциты (%).

Рис.2. Сравнительная оценка чувствительности лимфоцитов крови к ацетилхолину, норадреналину и преднизолону.


Анализ полученных результатов показал, что ацетилхолин статистически значимо увеличивал относительное содержание CD95+ - , CD3+95+ - и CD3-95+ лимфоцитов по сравнению с контролем в 1,7; 1,95 и 1,4 раза соответственно. При этом под влиянием ацетилхолина на гистограммах распределения клеток по параметру FSC появлялся дополнительный пик, свидетельствующий о появлении лимфоцитов с уменьшенными размерами.

Одновременно при проведении ДНК-цитометрии на гистограммах появлялся выраженный пик гиподиплоидных клеток (процент гиподиплоидных лимфоцитов возрастал с 0,5±0,2 в контроле до 11,5±1,2; р<0,001). Преднизолон оказывал аналогичное действие на изменение параметра FSC и содержание ДНК в лимфоцитах, но увеличение содержания клеток, позитивных по CD95-антигену было не столь выраженным, как под влиянием ацетилхолина.

Инкубация крови с норадреналином приводила к снижению экспрессии CD95- и CD3- антигенов на лимфоцитах, но при этом изменений FSC

параметров и содержания ДНК, характерных для апоптоза лимфоцитов, не

происходило.

Таким образом, анализ изменений показателей чувствительности лимфоцитов крови здоровых людей и экспериментальных животных к нейромедиаторам вегетативной нервной системы выявил, что ацетилхолин in vitro способен индуцировать апоптоз лимфоцитов, а норадреналин только подавляет их активность, снижая экспрессию CD3- и CD95- антигенов.

Разработанный методический подход был использован в дальнейшем для комплексной оценки изменений иммунной системы в динамике ИМ в эксперименте и клинике.

2. Результаты воспроизведения экспериментального инфаркта миокарда

При перевязке коронарной артерии ИМ был подтвержден характерными изменениями на ЭКГ и/или морфологическими признаками у 49 из 54 прооперированных собак (90,7%): у 24 животных (44,4%) развивался трансмуральный, в 27 случаях (50,0%) - нетрансмуральный инфаркт миокарда. В 7,4% случаев при развитии нетрансмурального ИМ не было выявлено наличия патологического зубца Q на ЭКГ, однако, наличие некроза сердечной мышцы было подтверждено на гистологических препаратах. Следует отметить, что у четырёх собак (7,4 % от числа прооперированных животных) на ЭКГ были выявлены признаки нового повреждения миокарда: у одной на 7-е и у трёх - на 14-е сутки эксперимента, в дальнейшем подтверждённые морфологически.

Анализ гистологических препаратов выявил характерные для экспериментального ИМ морфологические изменения в сердечной мышце животных: через 24 часа после операции в зоне ишемии обнаруживались признаки, характерные для завершения предынфарктной стадии; через 3-е суток морфологические изменения в сердечной мышце соответствовали стадии формирования ИМ; на 7-е сутки эксперимента обнаруживались признаки организации ИМ. При нетрансмуральном ИМ к 14-м суткам наблюдения выявлялись признаки завершения стадии организации ИМ, начала процессов рубцевания; при трансмуральном ИМ в эти сроки процессы организации ИМ прогрессировали незначительно по сравнению с 7-ми сутками, что означало некоторое замедление процессов заживления. При этом у двух животных данной группы на 7-е сутки и у трёх собак на 14-е сутки эксперимента были выявлены рецидивирующие инфаркты на фоне распространенных первичных трансмуральных очагов.

3. Оценка морфофункционального состояния лимфоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда

При изучении особенностей состояния лимфоцитов крови в динамике трансмурального и нетрансмурального ИМ в эксперименте нами были проанализированы изменения 20-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические параметры, выраженность процессов апоптоза и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы.

При возникновении нетрансмурального ИМ в эксперименте были выявлены изменения показателей морфофункционального состояния лимфоцитов крови в зависимости от срока реализации возникшего патологического процесса в сердечной мышце (рис.3).

Через сутки после перевязки коронарной артерии в крови у собак происходило снижение относительного содержания лимфоцитов. Для них было характерно значительное увеличение размеров клеток и ядер. При этом прирост площади ядер преобладал и приводил к повышению ЯЦО, что могло быть связано с перераспределением популяционного состава лимфоцитов и активацией клеток вследствие неспецифической реакции лейкоцитов на стресс. В данный срок эксперимента отмечалось повышение чувствительности клеток к проапоптотическому действию ацетилхолина in vitro.

На 3-и сутки наблюдалось снижение числа лейкоцитов в крови, возрастало содержание лимфоцитов, отмечалась некоторая стабилизация

1 - содержание лейкоцитов

2 - относительное содержание лимфоцитов

3 -абсолютное содержание лимфоцитов

4 - площадь клетки 5 -площадь ядра ядра

6 – ядерно-цитоплазменное отношение

7 –Индекс сдвига ацетилхолина (площадь клетки)

8 – Индекс сдвига ацетилхолина (площадь ядра)

9 - Индекс сдвига ацетилхолина (ЯЦО)

10 – Индекс сдвига норадреналина (площадь клетки)

11 – Индекс сдвига норадреналина (площадь ядра)

12 – Индекс сдвига норадреналина (ЯЦО)




Рис. 3. Изменение основных параметров морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда.


размеров клеток, однако, повышенные значения ЯЦО сохранялись. Чувствительность клеток к ацетилхолину продолжала нарастать.

Реализация процессов организации инфаркта миокарда (7-е сутки эксперимента) сопровождалась нормализацией морфометрических параметров клеток. Оставались изменёнными только параметры, характеризующие чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину. На 14-е сутки после возникновения нетрансмурального ИМ наблюдалось практически полное восстановление большинства показателей состояния лимфоцитов крови, их чувствительности к ацетилхолину, оставались повышенными (р<0,05) только значения абсолютного содержания лимфоцитов.

При развитии трансмурального ИМ характер изменений морфофункционального состояния лимфоцитов крови отличался более выраженным снижением относительного содержания лимфоцитов в крови в течение всего срока наблюдения и повышением чувствительности клеток к ацетилхолину. В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце циркулирующие в крови лимфоциты отличались низким ЯЦО, из-за интенсивного снижения площадей их ядер. Чувствительность лимфоцитов к ацетилхолину достигала максимальных уровней. На 3-и сутки после операции, в стадию формирования ИМ, отмечалась некоторая стабилизация морфометрических параметров лимфоцитов крови. При этом чувствительность клеток к ацетилхолину начинала постепенно снижаться. На 7-е и 14-е сутки после операции при нормализации большинства морфологических признаков чувствительность лимфоцитов к апоптотическому действию ацетилхолина оставалась высокой. Необходимо отметить, что максимальные значения индексов сдвига ацетилхолина наблюдались у животных непосредственно до возникновения новых очагов некроза в сердечной мышце на фоне развившегося трансмурального инфаркта миокарда.

Таким образом, в ходе исследования были выявлены сложные, отличающиеся по выраженности, динамические изменения состояния лимфоцитов, зависящие от тяжести поражения сердечной мышцы. Наиболее значительные изменения были характерны для показателей чувствительности лимфоцитов к апоптотическому действию ацетилхолина, максимальные при трансмуральном инфаркте миокарда. Все это свидетельствует о реактивном характере изменений показателей морфофункционального состояния лимфоцитов, максимально выраженных на начальных этапах реализации патологического процесса в сердечной мышце и отражающих, в первую очередь, неспецифическую реакцию лимфоцитов на появление очага некроза в организме. Выявленные изменения чувствительности к ацетилхолину при отсутствии реакции на норадреналин свидетельствуют о структурных и функциональных перестройках в лимфоцитах, связанных с их вовлечением в патологический процесс при ИМ и регуляции вегетативной нервной системой иммунологических реакций посредством модуляции апоптоза лимфоцитов.

С целью проведения интегральной и объективной оценки выявленных изменений в лимфоцитах, а также определения закономерностей и направленности их реагирования в динамике экспериментального ИМ мы применили системный многофакторный анализ с построением математических моделей (рис.4).

Рис. 4. Изменения интегральных показателей морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при экспериментальном инфаркте миокарда.


Анализ математической модели морфофункционального состояния лимфоцитов крови собак при возникновении нетрансмурального ИМ выявил, что изменения интегральных показателей системы носили колебательный характер, с максимальной активацией системы на 1-е сутки и постепенной нормализацией состояния к 14 суткам наблюдения. В 1-е и 3-и сутки после возникновения нетрансмурального ИМ наибольшее влияние на общее состояние модельной системы лимфоцитов, оцененное по изменениям весовых коэффициентов отдельных показателей, оказывали значения ЯЦО (Pi=388,6 и 545,3, соответственно), относительное содержание лимфоцитов в крови (Pi=147 и 60, соответственно), индексы сдвига ацетилхолина по площадям клетки (Pi=136,3 и 116,4, соответственно).

На 7-е сутки эксперимента наибольшее влияние имели значения ЯЦО (Рi=170,3), общее содержание лейкоцитов (Pi=100,1) и индекс сдвига ацетилхолина по площади клеток (Pi=85,3). На 14-е сутки после развития нетрансмурального ИМ, при приближении интегрального показателя к норме, максимально высокие значения весовых коэффициентов были у ЯЦО (Pi=389,2); индекса сдвига ацетилхолина (Pi=113,3); относительного содержания лимфоцитов (Pi=100,7).

При развитии трансмурального экспериментального ИМ характер и направленность математической модели морфофункционального состояния системы лимфоцитов крови отличались от описанных для нетрансмурального, особенно на 3-и сутки эксперимента. К 14-м суткам наблюдения имели место признаки активации системы, выражающиеся в увеличении значений интегрального показателя. Полной нормализации состояния модельной системы лимфоцитов не происходило. Через сутки после развития трансмурального ИМ наиболее значимый вклад в функционирование системы вносили такие параметры лимфоцитов, как индекс сдвига ацетилхолина по площади ядра (Pi=342,9) и площади клетки (Pi=297,2), ЯЦО (Pi=100,2). На 3-и сутки эксперимента - в момент максимального отклонения состояния системы от нормы – наиболее важными для её активности являлись показатели, характеризующие чувствительность клеток к апоптотическому действию ацетилхолина (для показателей индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов Pi=562,0). На 7-е сутки наибольшее влияние на морфофункциональное состояние системы оказывали ЯЦО (Pi=542,0) и индекса сдвига ацетилхолина по площади лимфоцитов (Pi=102,0). На 14-е сутки наиболее важными для состояния системы явились изменения ЯЦО (Pi=545,5) и относительное содержание лимфоцитов в крови (Pi=104,5).

Таким образом, в динамике развития экспериментального инфаркта отмечаются колебательные изменения активности лимфоцитов с максимальным отклонением от нормы на 1-е (при нетрансмуральном ИМ) и 3-и (трансмуральный ИМ) сутки после перевязки коронарной артерии. Наиболее выраженные отклонения в состоянии модельной системы лимфоцитов от нормы наблюдаются при трансмуральном инфаркте миокарда. Наиболее значимыми для состояния системы являются показатели ЯЦО и чувствительности лимфоцитов к проапоптотическому действию ацетилхолина, что подтверждает важную роль парасимпатической нервной системы в регуляции иммунокомпетентных клеток при экспериментальном инфаркте миокарда.

Вне зависимости от степени повреждения сердечной мышцы в начальный период формирования очага некроза в миокарде именно изменения парасимпатической регуляции состояния иммунной системы являются ведущими. В стадию формирования ИМ (3-и сутки), в момент максимальной активации системы при нетрансмуральном ИМ критическое значение имеют значения ЯЦО и сниженное содержание лимфоцитов в крови, а при трансмуральном - высокая чувствительность клеток к ацетилхолину. На 7-е сутки, в период организации ИМ, при его более тяжелом течении чувствительность клеток к ацетилхолину менее выражена. В период завершения стадии организации ИМ и начала процессов рубцевания (14-е сутки), возрастание коэффициентов влияния ацетилхолина на лимфоциты является отражением напряженности системы и готовности лимфоцитов к восприятию регулирующих сигналов. Максимальная выраженность значений коэффициентов влияния показателей чувствительности лимфоцитов к ацетилхолину является признаком неблагоприятного течения патологического процесса.

4. Оценка морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови при экспериментальном инфаркте миокарда

При изучении особенностей состояния нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике нетрансмурального и трансмурального ИМ в эксперименте нами были проанализированы изменения 16-ти показателей, характеризующих морфологические, морфометрические, цитохимические параметры, фагоцитарную активность и чувствительность к нейромедиаторам симпатического и парасимпатического звеньев вегетативной нервной системы - ацетилхолину и норадреналину в реакции фагоцитарной активности; проведены расчет и оценка лейкоцитарных индексов (ИСЛК, ЛИИ).

При возникновении нетрансмурального ИМ у собак реализация стадий формирования, организации и начала рубцевания ИМ сопровождалась динамическими изменениями показателей морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов (рис. 5).

1 - Содержание лейкоцитов, кл.х109

2 - Относительное cодержание нейтрофильных гранулоцитов, %

3 - Абсолютное содержание нейтрофильных гранулоцитов,клеток х10 9

4 - Индекс сдвига лейкоцитов крови

5 – Лейкоцитарный индекс интоксикации

6 -Площадь клетки, мкм2

7 - Площадь ядра, мкм2

8 - Ядерно-цитоплазменное отношение

9 - Активность миелопероксидазы, усл.ед.

10 - Содержание гликогена, усл.ед.

11 - Содержание фосфолипидов, усл. ед

12 - Фагоцитарная активность лейкоцитов,%

13 – Фагоцитарная активность лейкоцитов в присутствии ацетилхолина,%

14 - Фагоцитарная активность лейкоцитов в присутствии норадреналина,%

15 – Индекс сдвига ацетилхолина, усл.ед.

16 – Индекс сдвига норадреналина, усл.ед.



Рис. 5. Изменения основных параметров морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда


В 1-е сутки в крови животных на фоне выраженного увеличения общего количества лейкоцитов статистически значимо (р<0,05) возрастало относительное и абсолютное содержание нейтрофильных гранулоцитов (в 1,9 и 1,7 раз по сравнению с контролем, соответственно). Происходило увеличение значений ИСЛК и ЛИИ в 2,5 раза и в 1,6 раза соответственно; морфометрические характеристики при этом не изменялись. Возрастала активность миелопероксидазы, фагоцитарная активность, увеличивалось содержание в клетках гликогена.

Описанные изменения свидетельствовали о функциональной активации нейтрофильных гранулоцитов и перераспределительном лейкоцитозе, связанном со стрессовой реакцией организма на возникновение очага некроза. Оценка чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам вегетативной нервной системы выявила снижение реакции клеток на норадреналин и ацетилхолин. На 3-и сутки выраженность изменений количественных и функциональных показателей нейтрофильных гранулоцитов снижалась. Реакция клеток на норадреналин нормализовалась, чувствительность к ацетилхолину возрастала. На 7-е сутки оставались повышенными только ИСЛК и ЛИИ (р<0,05). К 14-м суткам эксперимента происходила нормализация большинства показателей морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов.

При развитии трансмурального ИМ изменения морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови были более выраженными.

В 1-е сутки формирования очага некроза в сердечной мышце отмечался максимально выраженный нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом лейкоцитарной формулы крови влево, вследствие чего максимально возрастали значения ИСЛК и ЛИИ. В нейтрофильных гранулоцитах значительно падала активность миелопероксидазы, уменьшалось содержание гликогена и возрастало содержание фосфолипидов, клетки отличались сниженной фагоцитарной активностью. Чувствительность клеток к норадреналину была максимальной, к ацетилхолину – минимальной.

На 3-и сутки отмечалась тенденция к нормализации показателей состояния нейтрофилов, однако, менее выраженная, чем при нетрансмуральном ИМ. На 7-е сутки эксперимента были повышены средние значения относительного содержания нейтрофильных гранулоцитов, их площадь, ИСЛК, снижена чувствительность клеток к норадреналину и ацетилхолину. У животных с развившимся в дальнейшем повторным ИМ отмечалась максимальная выраженность указанных изменений. К 14-м суткам достоверно повышались средние значения общего содержания лейкоцитов в кровотоке и абсолютное количество нейтрофильных гранулоцитов, ЛИИ, ИСЛК, ЯЦО, реакция нейтрофильных гранулоцитов на нейромедиаторы вегетативной нервной системы оставалась сниженной.

Математические модели морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов крови при нетрансмуральном и трансмуральном ИМ (рис.6) отличались по выраженности отклонений интегральных показателей от нормы, однако общая направленность изменений активности системы была сходной с отклонением в сторону отрицательных величин на 7-е сутки.



Рис. 6. Изменение интегральных показателей системы нейтрофильных гранулоцитов крови собак в динамике экспериментального инфаркта миокарда


Анализ изменения ранжированных коэффициентов влияния показал, что при нетрансмуральном ИМ в 1-е сутки развития патологического процесса наиболее значимыми для функционирования системы являлись показатели чувствительности к норадреналину (Pi=202,0); относительного содержания нейтрофилов (Pi=208,4); площади ядра (Pi=203,6), при трансмуральном ИМ - ЛИИ (Pi=1664,4); активности миелопероксидазы (Pi=537,4); индекса сдвига ацетилхолина (Pi=166,4). Ранжированное распределение коэффициентов влияния показателей на 3-и сутки нетрансмурального и трансмурального ИМ было одинаковым: наиболее весомыми были активность миелопероксидазы (Pi=538,4 и 412,5, соответственно), содержание фосфолипидов (Pi=334,6 и 212,5 соответственно), индекс сдвига ацетилхолина (Pi=105,3 и 102,5, соответственно).

На 7-е сутки наблюдения распределение показателей по значимости для функционирования системы отличались только тем, что максимальные значения при трансмуральном ИМ имело изменение площадей ядер нейтрофильных гранулоцитов (Pi=208,2). Через 14 суток, независимо от формы ИМ, ведущими были изменения значений площадей клеток, активности в них миелопероксидазы и, при трансмуральном ИМ, индексы сдвига ацетилхолина (Pi=102,4) и норадреналина (Pi=104,2).

В целом, системный многофакторный анализ морфофункционального состояния нейтрофильных гранулоцитов позволил выявить характерные закономерности реагирования данных клеток на возникновение очага некроза в сердечной мышце. Выраженность изменений морфофункционального состояния клеток отражает динамику их перераспределения в крови и тканях, а также функциональную активность в зависимости от этапов развития экспериментального ИМ. Установлено, что изменения показателей чувствительности нейтрофильных гранулоцитов к нейромедиаторам коррелировали с тяжестью течения патологического процесса.

5. Математическое моделирование морфофункционального состояния иммунной системы при экспериментальном инфаркте миокарда

С целью комплексной оценки морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза животных при экспериментальном ИМ нами на основе системного многофакторного анализа с учётом показателей, характеризующих морфофункциональное состояние лейкоцитов крови, уровней имму-ноглобулинов основных классов и С-РБ в крови, а также активности системы комплемента была создана математическая модель состояния иммунной системы в целом. Для рабочей модели были выбраны показатели с высокими значениями весовых коэффициентов в соответствующей модельной системе (рис. 7).

Согласно результатам сравнительного анализа математических моделей, в первые трое суток после воспроизведения экспериментального ИМ характер и

Рис. 7. Математические модели морфофункционального состояния иммунной системы при экспериментальном инфаркте миокарда

направленность изменений активности иммунной системы определяется состоянием как лимфоцитов, так и нейтрофильных гранулоцитов, после 7-х суток максимально значимой является активность лимфоцитов крови. При развитии трансмурального ИМ отклонения интегральных показателей иммунной системы от нормативных значений были наиболее выраженными. С учётом ранжированной оценки весовых коэффициентов, эти результаты отражают этапы реагирования иммунной системы на возникновение ИМ и подтверждают важную роль вегетативной нервной системы в регуляции иммунологических процессов при инфаркте миокарда.

Выявленные изменения чувствительности лимфоцитов крови к норадреналину и ацетилхолину сопровождались изменениями морфометрических характеристик клеток, что могло явиться как отражением перераспределения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, так и изменением плотности рецепторов к нейромедиаторам в ответ на изменения активности вегетативной нервной системы.

Для определения закономерностей выявленных изменений и сопоставления их с клиническими данными, нами была проведена комплексная, на основе системного многофакторного анализа, оценка морфофункционального состояния системы иммунного гомеостаза человека при остром ИМ с зубцом Q и без формирования зубца Q.

1   2   3   4


База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка