Удк гетерогенність популяції стафілококів за ознакою метицилінрезистентності




Скачати 122.7 Kb.
Дата конвертації21.04.2016
Розмір122.7 Kb.
УДК

ГЕТЕРОГЕННІСТЬ ПОПУЛЯЦІЇ СТАФІЛОКОКІВ ЗА ОЗНАКОЮ МЕТИЦИЛІНРЕЗИСТЕНТНОСТІ

Коцар О. В., Воронкіна І.А., Деркач С. А., Крилова І. А., Габишева Л.С.

ДУ «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова Національної академії медичних наук України»

Одним з головних факторів, що знижує ефективність лікування антибіотиками, є постійно прогресуюча резистентність мікроорганізмів до лікарських засобів. Більшість вчених схиляються до думки, що антимікробна резистентність - це глобальна пандемія, яка загрожує життю кожному пацієнту [1, 2].

Особливого значення набуває формування полірезистентності у штамів стафілококів, які є збудниками цілого ряду як нозокоміальних, так і позалікарняних захворювань.

Не дивлячись на досягнення мікробіології та практичної медицини, проблеми стафілококової інфекції в клінічній практиці стоять досить гостро.

Боротьба з стафілококовою інфекцією ускладнюється також тим, що даний мікроорганізм надзвичайно поширений у природі і його часто знаходять як у кишечнику так і на поверхні шкіри клінічно здорових людей, він здатний вегетувати і накопичуватись в різноманітних об'єктах навколишнього середовища. Останнім часом, унаслідок неконтрольованого та незавжди раціонального використання антибіотиків, антисептиків і дезінфектантів формуються та широко поширюються мультирезистентні щодо антибіотиків стафілококи [3]. При цьому потенційно найнебезпечнішими є оксациліностійкі штами стафілококів (метицилінрезистентні стафілококи – MRS).

Препаратами вибору для лікування стафілококової інфекції є бета-лактамні антибіотики. При виявленні у штамів метицилінрезистентності вони вважаються стійкими до всіх бета-лактамних антибіотиків. Більш того, такі штами, як правило, володіють полірезисентністю відносно інших класів антибіотиків [4, 5].

Отже, визначення чутливості до метициліну (оксациліну) кожного вилученого штаму є обов’язковою умовою для призначення адекватної антибіотикотерапії стафілококової інфекції.

Основним методом при цьому в лабораторній практиці залишається диско-дифузійний (ДДМ). При використанні дисків з антибіотиками нерідко отримуються сумнівні результати. Однією із причин такого явища є наявність у досліджуваних штамів гетерогенності популяції.

Гетерогенність - це розщеплювання однорідної популяції на варіанти, які відрізняються від початкової форми морфологічними, культуральними, фізіологічними, біохімічними та іншими ознаками [1]. Зміни при дисоціаціях носять постійний і оборотній характер і відбувається з частотою 10-2 – 10-4 на одне клітинне ділення. Інтерес до процесу дисоціації значно виріс у зв’язку з розвитком антибіотикорезистентності. Популяції стафілококу, як і інші види бактерій, гетерогенні за ознакою чутливості до антибіотиків. Феномен гетерогенності популяції за ознакою антибіотикостійкості визначається наявністю у популяції резистентного штаму субпопуляції з різними рівнями стійкості антибіотику [6].

Штами навіть з класичним типом резистентності можуть бути як гомо- так і гетерогенними за типом експресії резистентності. При гомогенному типу практично всі мікробні клітини проявляють резистентність у стандартних in vitro тестах, в той час як при гетерогенному типі невелика кількість клітин проявляє фенотипову резистентність.

Метою досліджень було визначення гетерогенності популяції стафілококів за ознакою метицилінрезистентності.

Матеріал та методи дослідження. Для вирішення даної мети нами було досліджено 57 позалікарняних штамів стафілококу, виділених від хворих із різними проявами гнійно-запальних процесів.

Попередньо була визначена їх чутливість до оксациліну (метициліну) диско-дифузійним методом (ДДМ). Слід звернути увагу на те, що згідно методичним рекомендаціям метицилінрезистентним штамом вважається штам, якщо діаметр затримки росту навколо диску з оксациліном не перевищує 13 мм, або відмічається (діаметр затримки росту навіть більш 13 мм) більше двох колоній стафілококу.

Для визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) метициліну (оксациліну) використовували метод послідових серійних розведень в поживному бульйоні з додаванням 4 % NaCl згідно з МВ 9.9.5 – 143-2007 [5, 7]. Метод оснований на послідовних двократних розведеннях антибіотику. Для приготування основного розчину антибіотика використовували оксацилін (РФ ОАО «Органика»).

Визначення МІК хіміотерапевтичної речовини проводили мікрометодом на 96-лункових планшетах (Sarstedt, Германія). В кожну лунку вносили культуру з кінцевою концентрацією досліджуваного мікроорганізму, яка відповідає стандарту каламутності 0,5 по McFarland, в об’ємі 0,1 мкл, додавали антибіотик зазначеної концентрації. Залишали в термостаті на 18-20 годин. Облік результатів проводили візуально, порівнюючи ріст мікроорганізму у присутності АБП із ростом культури у лунці без АБП. За МІК приймали мінімальну концентрацію, що забезпечує повне пригнічення видимого росту досліджуваного штаму [5].

Вивчення гетерогенності популяції стафілококів за ознакою резистентності до метициліну проводили за допомогою методу відбитків (Дж. Ледерберг, Е. Ледерберг) [8].

Колонію досліджуваної культури стафілококу, з відомою МІК оксациліну, розсівали по Голду на ЖСА, повторно відбирали ізольовані колонії та повторювали цей цикл 5 разів. Матеріал однієї колонії із останнього пасажу пересівали на скошений агар (МХ). Підрощену культуру доводили фізіологічним розчином до 1,5Х108 КУО/мл.

На чашку-матрицю з середовищем Мюлера-Хінтона (МХ) наносили 0,2 мл інокулюму методом «газону». Після добового інкубування в термостаті за допомогою штампа-реплікатора робили відбитки з підрослими колоніями на чашки-реплики, які містили зазначені концентрації оксациліну: 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 8 мкг/мл, 16 мкг/мл, 32 мкг/мл, 64 мкг/мл, 128 мкг/мл.

В якості контролю робили висів досліджуваної культури на МХ без оксациліну. Після інкубування при Т 35ºС в термостаті протягом 24 годин обліковували результати. Кількість колоній, що виросли на щільних середовищах з різною концентрацією оксациліна, відповідало кількості колоній, стійких до цієї концентрації оксациліну, і визначалась у відсотках від кількості колоній, які виросли на середовищі без антибіотику. Таким чином, визначалась питома вага штамів з різним значенням МІК до оксациліну [9].



Результати досліджень та їх обговорення

В залежності від значення рівня чутливості стафілококів до оксациліну (при використанні методу послідових серійних розведень в бульйоні) штами розподілили на MRSA, MSSA та з пограничною резистентністю – BSSA (borderline-susceptible S. aureus). До MSSA відносяться штами, значення МІК яких складає від 0,5 до 2 мкг/мл, до групи BSSA – від 2 до 4 мкг/мл, до MRSA - 4 мкг/мл і більше (табл. 1).



Таблиця 1. Результати визначення рівня МІК клінічних штамів

S. aureus (n=57) методом серійних розведень

Значення МІК, мкг/мл

Абс.ч

М±m

від 0,5 до 2 (MSSA)

27

47,4±6,6

від 2 до 4 (BSSA)

10

17,5±5,0

від 4 і > (MRSA)

20

35,1±6,3

Із таблиці 1 видно, що серед ізолятів S. aureus було виявлено 47,4 % MSSA штамів, 35,1 % - MRSA-штамів та 17,5 % - BSSA. Останніх було достовірно менше (χ2<0,05).

При дослідженні ступеня антимікробної активності оксациліну виявлено принципові відмінності характеристик розподілу штамів MRSA. В 50,0 % випадках штами S. aureus мали МІК оксациліну 4,0 мкг/мл. Концентрація оксациліну 8 мкг/мл затримувала ріст 20,0 % досліджених культур. Для 15,0 % штамів МІК склала 16 мкг/мл, для 5,0 % - від 32 до 128 мкг/мл.

Характер розподілу штамів клінічних ізолятів золотистого стафілококу зображено на рис.1.



Рис. 1. Розподіл за рівнем резистентності до оксациліну різних клінічних ізолятів MRSA.

Для визначення гетерогенності популяцій було взято 11 клінічних ізолятів S. aureus з різними рівнями стійкості до оксациліну: №1 – МІК 0,5 мкг/мл, №2 – 1,0 мкг/мл, №3 – 2,0 мкг/мл, №4 – 4,0 мкг/мл, №5 - 4,0 мкг/мл, №6 - МІК 8 мкг/мл, №7 - МІК 16 мкг/мл, №8 - МІК 32 мкг/мл, №9 - МІК 64 мкг/мл, №10 - МІК 128 мкг/мл.

Висівали культуру на чашки з середовищем МХ, які містили 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0;16,0; 32,0; 64,0; 128,0 мкг/мл оксациліну. В якості контролю штам сіяли на чашку без антибіотика. Кількість колоній, що виросли на контрольних чашках складало 97-100% від розрахованого числа КУО, що свідчило про достатню кількість матеріалу на реплікаторі, необхідного для висіву на всі чашки реплики.

Отже, кількість колоній, які виросли на чашках-репликах з різною концентрацією антибіотика відповідало кількості клітин у популяції, стійких до цієї концентрації оксациліну, і визначалась в відсотках від числа колоній на чашці без препарату. Отримані дані приведені на рис. 2.





Рис. 2. Субпопуляції штамів S. aureus з різними рівнями МІК

Із отриманих даних видно, що популяції всіх досліджених штамів гетерогенні за ознакою метицилінорезистентності.

Можна зробити підсумок: серед популяції штамів S. aureus, які віднесені за результатами наших дослідженнь до метициліночутливих та до штамів з пограничною резистентністю, 11 % клітин популяції виявились стійкими до порогового значення оксациліну (МІК=4 і > мкг/мл). Саме наявність такої гетерогенності у популяції стафілококу здатна формувати метицилінорезистентність у циркулюючих штамів.

Експресія гетерогенності більш характерна для штамів з низьким та середнім значенням МІК.

Саме наявністю гетерогенності популяцій стафілококу можна пояснити факт низької ефективності лікування хворих бета-лактамами цефалоспорінового ряду, не дивлячись на задовільну чутливість до них вилучених штамів стафілококу при визначенні ДДМ. Хіміотерапевтична резистентність в таких випадках формується уже під час лікування як реакція -відповідь мікроба на селективний тиск антибіотикотерапії [10].

Для стафілококів є характерною здатність швидко адаптуватись до дії антибактерійних препаратів, формуючи до них резистентсність. Це досить наглядно було підтверджено експериментальним шляхом науковцями Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова [10].

Проводячи пасажування штамів S. aureus на МПБ із збільшенням концентрації досліджуваних антибіотиків, автори виявили зниження чутливості до пеніцилінів уже на п'ятому пасажі більше ніж у 128 разів, до цефалоспоринів І, ІІІ поколінь у 32-64 рази, починаючи з 10 пасажу, до глікопептидів – у 128 разів після 10 пасажів, до макролідів – у 16 разів з п'ятого пасажу, в порівнянні із вихідними значеннями чутливості [204].

Аналогічна ситуація може мати місце не тільки in vitro, але і in vivo: в процесі лікування антибіотиками за рахунок гетерогенності популяції відбувається селекція стійких субодиниць, які виживють після лікування хворого та передаються іншому пацієнту. Внаслідок лікування хворого, знову "виживають" штами з підвищеною стійкістю до антибіотиків, що в кінці кінців призводить до формування полірезистентних штамів.

Метицилінрезистентність стафілококів має складні молекулярні основи. Крім гену mec А мають значення інші хромосомні фактори. Характерною рисою резистентності до метициліну є її гетерогенна експресія.

За даними різних авторів резистентність до оксациліну низького рівня виявляється у штамів, позбавленого гену mec А. Вона пов’язана з гіперпродукцією бета лактамаз і, можливо, метициліназ, а також з модифікаціями нормальних пеніцилін-звязуючих білків. На фенотип резистентності впливає багато факторів, в тому числі регуляторні елементи бета-лактамази фактори і ще не ідентифіковані хромосомні локуси [11].



Висновки:

  1. Виявлена (методом ДДМ) та підтверджена шляхом визначення МІК оксациліну наявність у позалікарняних штамів S. aureus метицилінрезистентності різного ступеню (MSSA - 47,4 %, BSSA - 17,5 %, MRSA - 35,1 %).

  2. Експериментально підтверджена наявність гетерогенності за ознакою та рівнем метицилінрезистентності практично у всіх досліджених штамів.

  3. Найбільша експресія гетерогенності характерна для штамів з низьким та середнім значенням МІК.

  4. Гетерогенна природа резистентності до метициліну є серйозною перешкодою при лабораторному тестуванні звичайними методами, що в свою чергу ускладнює вибір ефективної антибіотикотерапії хворих стафілококовою інфекцією.

References:

  1. Kuchma, I. U. Geterogennist za kriteriami biologichnih vlastivostey ta chutlivocti do protimikrobnih zacobiv bacteriy rodu Streptococcus, vegetuiuchih v dihalniy systemi hvorih na pneumoniu [Теxt] / І. U. Kuchma // Infekciyni hvorobi. – 2013. – № 1. – P. 69–73.

  2. Volianskiy, U. L SOS v priamom i perenosnom smisle. Novaia strategia borbi s razvitiem uctoychivocti k antibiotikam [Text] / U. L. Volianskiy, T. U. Kotlova, І. U. Kuchma // Teoretichna medicine. – 2013. – t. 19, No 2. – P. 162–170.

  3. Filimonova, N. І. Mikrobiologichne obgruntuvannia principu ctvorennia komplexnih аntimicrobnih preparativ z uperedguvalnimi vlactivoctiami shodo formuvannia antibioticresistantnocti [Text] / N. І. Filimonova, V. М Оctapenko., І. L. Dikiy., V. V. Kovalyova // Vicnik pharmacii. – 2005. – № 1 (41). – P. 69–72.

  4. Metodicheckie ukazania po primeneniu unificirovanih mikrobiologicheckih (bacteriologicheckih) metodov issledovania v kliniko-diagnosticheskih laboratoriah [Text]: [prilogenie № 1 к prikazu МZ СССR № 535 оt 22 April 1985 y.] – 45 p.

  5. Nakaz MOZ Ukraine № 167 Pro zatverdgennia metodichnih vkazivok: Viznachennia chutlivocti mikroorganizmiv do antibacterialnih preparative : [Text] / [Chinniy vid 2007-04-05]. – Regim doctupu: http://mozdocs.kiev.ua.

  6. Moellenng, R. C. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus: no longer confined to the inpatient arena [Text] / R. C. Moellenng // Infect. Dis. Special Edition. – 2003. – №6. – P. 63–67.

  7. Dehnich, А. V. Epidemiologia antibiotic resistance nozokomialnih shtammov Staphylococcus aureus v Rossii: resultati mnogocentrovogo issledovania [Text] / А. V. Dehnich, I. А. Eydelshteyn, А. D. Narezkina // КMAH. – 2002. – № 4. – P.25–36.

  8. Lederberg, J. 50 eves. Orvosi Hetilap [Text] / J. Lederberg. – 1975. – № 116(36). – Р. 2135–2136.

  9. Methicillinresistence Staphylococcus aureus – vozbuditeli vnutribolnichnih infekciy: identification and genothipirovanie [Text]. – Москва, 2006. – 44 p.

  10. Paliy, V. G. Doclidgennia protimikrobnih vlactivoctey kompozicii na ocnovi dekametoxinu / V. G. Paliy [et al.] // Naukoviy visnik Uggorodckogo university serious «Medcine». – 2012. – vol. 1 (43) – P. 48-52.

  11. Кuciк, R. V. Pohidni tiazolidonu – noviy klas spoluk, zdatnih vidnovluvati chutlivict Methycillinresistente Staphylococcus dо ß-laktamnih аntibiotikiv [Text] / R. V. Кuciк, R. B. Lecik, L. M. Кurovec // Biomedical and Biosocial Anthropology. – 2008. – №11. – P.65–68.

УДК

ГЕТЕРОГЕННІСТЬ ПОПУЛЯЦІЇ СТАФІЛОКОКІВ ЗА ОЗНАКОЮ МЕТИЦИЛІНРЕЗИСТЕНТНОСТІ

Коцар О. В., Воронкіна І.А., Деркач С. А., Крилова І. А., Габишева Л.С.

Ідентифіковано 57 штамів стафілококу, вилучених від позалікарняних хворих стафілококовою інфекцією. Визначена їх метицилінрезистентність диско-дифузійним методом та методом серійних розведень з визначенням МІК оксациліну. В дослідженнях in vitro виявлена наявність гетерогенності культур з ознакою метицилінрезистентності. Показано, що експресія гетерогенності більш характерна для штамів з низьким та середнім значенням МІК оксациліну.



Ключові слова: стафілококова інфекція, метицилінрезистентність, гетерогенність.

УДК

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОПУЛЯЦИИ СТАФИЛОКОККОВ ПО ПРИЗНАКУ МЕТИЦИЛЛИНРЕЗИСТЕНТНОСТИ

Коцарь Е.В., Воронкина И.А., Деркач С.А., Крылова И.А., Габышева Л.С.

Идентифицировано 57 штаммов стафилококка, выделенных от внебольничных больных с стафилококковой инфекцией. Определена их метициллинрезистентность диско-диффузионным методом и методом серийных разведений с определением МИК оксацилина. В исследованиях in vitro определено наличие гетерогенности культур с признаком метициллинрезистентности. Показано, что экспрессия гетерогенности в большей степени характерна для штаммов с низким и средним значением МИК оксацилину.



Ключевые слова: стафилококковая инфекция, метициллинрезистентность, гетерогенность.

UDK

HETEROGENEITY OF STAPHYLOCOCCUS POPULATION ON THE BASIS OF METYTSYLIN RESISTANCE

O.V. Kotsar, I.A. Voronkina, S.A. Derkach, I.A. Krylova, L.S. Gabisheva

57 Staphylococcus strains were identified and excluded from patients. Metytsylin resistance of these strains was determined using disc-diffusion method and method of serial dilutions with oxacillin MIC determination. In in vitro studies of heterogeneity for the cultures with metytsylin resistance was revealed. Expression of heterogeneity was shown to be more typical for strains with low and average levels of oxacillin MICs.



Keywords: staphylococcal infection, metytsylin resistance, heterogeneity.




База даних захищена авторським правом ©mediku.com.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка